एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफ़ी: Difference between revisions

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एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी [[बायोमोलिक्यूल]] और अन्य पदार्थ के बीच अत्यधिक विशिष्ट आणविक बाध्यकारी बातचीत के आधार पर, बायोमोलेक्यूल को मिश्रण से अलग करने की एक विधि है। विशिष्ट प्रकार की बाध्यकारी बातचीत ब्याज के बायोमोलेक्यूल पर निर्भर करती है; प्रतिजन और [[एंटीबॉडी]], [[एंजाइम]] और [[सब्सट्रेट (जैव रसायन)]], [[जैव रसायन रिसेप्टर]] और [[लिगैंड (जैव रसायन)]], या [[प्रोटीन]] और [[ न्यूक्लिक अम्ल ]]<ref>{{Cite journal|last1=Aizpurua-Olaizola|first1=Oier|last2=Sastre Torano|first2=Javier|last3=Pukin|first3=Aliaksei|last4=Fu|first4=Ou|last5=Boons|first5=Geert Jan|last6=de Jong|first6=Gerhardus J.|last7=Pieters|first7=Roland J.|date=January 2018|title=कार्बोहाइड्रेट आधारित हैजा विष अवरोधकों की बाध्यकारी आत्मीयता के आकलन के लिए आत्मीयता केशिका वैद्युतकणसंचलन|journal=Electrophoresis|language=en|volume=39|issue=2|pages=344–347|doi=10.1002/elps.201700207|pmid=28905402|s2cid=33657660}}</ref> विभिन्न जैव अणुओं के अलगाव के लिए बाध्यकारी अंतःक्रियाओं का अक्सर उपयोग किया जाता है। आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी इसकी उच्च [[चयनात्मकता (क्रोमैटोग्राफी)]] और अलगाव के [[संकल्प (क्रोमैटोग्राफी)]] के लिए उपयोगी है,<ref>{{Cite book|title=जैव रसायन और जैव प्रौद्योगिकी के लिए मौलिक प्रयोगशाला दृष्टिकोण|last1=Ninfa|first1=Alexander J.|last2=Ballou|first2=David P.|last3=Benore|first3=Marilee|publisher=Wiley|year=2009|isbn=9780470087664|edition=2nd|page=133}}</ref><ref>{{cite web |url=https://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/introduction-affinity-chromatography?ID=MWHAVG4VY |title="एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी का परिचय"|author=<!--Not stated--> |date=2020-09-14 |website=bio-rad.com |publisher=Bio-Rad |access-date=2020-09-14 }}</ref> अन्य क्रोमैटोग्राफिक विधियों की तुलना में।
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== सिद्धांत ==
== सिद्धांत ==
आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी में रुचि के विश्लेषण (आमतौर पर मोबाइल चरण में भंग), और एक बाध्यकारी भागीदार या लिगैंड ([[स्थिर चरण (रसायन विज्ञान)]] पर स्थिर) के बीच विशिष्ट बाध्यकारी बातचीत का लाभ होता है। एक विशिष्ट आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी प्रयोग में, लिगैंड एक ठोस, अघुलनशील मैट्रिक्स से जुड़ा होता है - आमतौर पर एक बहुलक जैसे कि [[agarose]] या [[polyacrylamide]] - प्रतिक्रियाशील [[कार्यात्मक समूह]]ों को पेश करने के लिए रासायनिक रूप से संशोधित किया जाता है जिसके साथ लिगैंड प्रतिक्रिया कर सकता है, जिससे स्थिर सहसंयोजक बंधन बनते हैं।<ref>{{Cite book|title=Affinity Chromatography: Methods and Protocols|editor-last=Zachariou|editor-first=Michael |date=2008|publisher=Humana Press|isbn=9781588296597|edition=2nd|location=Totowa, N.J.}}</ref>{{page needed|date=December 2021}} स्थिर चरण को पहले एक कॉलम में लोड किया जाता है जिसमें मोबाइल चरण पेश किया जाता है। अणु जो लिगैंड से बंधते हैं, स्थिर चरण से जुड़े रहेंगे। उसके बाद स्थिर चरण के साथ उनकी कमजोर अंतःक्रियाओं को बाधित करके गैर-लक्षित जैव अणुओं को हटाने के लिए एक वॉश बफर लगाया जाता है, जबकि ब्याज के जैव अणु बाध्य रहेंगे। लक्ष्य बायोमोलेक्यूलस को एक तथाकथित रेफरेंस बफर लगाने से हटाया जा सकता है, जो बाध्य लक्ष्य बायोमोलेक्युलस और लिगैंड के बीच बातचीत को बाधित करता है। लक्ष्य अणु इस प्रकार eluting समाधान में पुनर्प्राप्त किया जाता है।<ref name="protein">{{Cite book|title=प्रोटीन शोधन|last1=Bonner |first1= Philip L.R.|date=2007|publisher=Taylor & Francis Group|isbn=9780415385114|edition=2nd|location=Totowa, N.J.}}</ref>{{page needed|date=December 2021}}
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एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी को आणविक भार, चार्ज, हाइड्रोफोबिसिटी, या रुचि के विश्लेषण के अन्य भौतिक गुणों की आवश्यकता नहीं होती है, हालांकि इसके बाध्यकारी गुणों का ज्ञान पृथक्करण प्रोटोकॉल के डिजाइन में उपयोगी होता है।<ref name="protein" />एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी प्रक्रियाओं में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले बाध्यकारी इंटरैक्शन के प्रकार नीचे दी गई तालिका में संक्षेप में दिए गए हैं।
एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी को आणविक भार, चार्ज, हाइड्रोफोबिसिटी, या रुचि के विश्लेषण के अन्य भौतिक गुणों की आवश्यकता नहीं होती है, हालांकि इसके बाध्यकारी गुणों का ज्ञान पृथक्करण प्रोटोकॉल के डिजाइन में उपयोगी होता है।<ref name="protein" />एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी प्रक्रियाओं में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले बाध्यकारी इंटरैक्शन के प्रकार नीचे दी गई तालिका में संक्षेप में दिए गए हैं।
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=== विभिन्न आत्मीयता मीडिया ===
=== विभिन्न आत्मीयता मीडिया ===

Revision as of 21:46, 21 March 2023

एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी बायोमोलिक्यूल और अन्य पदार्थ के बीच अत्यधिक विशिष्ट आणविक बाध्यकारी बातचीत के आधार पर, बायोमोलेक्यूल को मिश्रण से अलग करने की एक विधि है। विशिष्ट प्रकार की बाध्यकारी बातचीत ब्याज के बायोमोलेक्यूल पर निर्भर करती है; प्रतिजन और एंटीबॉडी, एंजाइम और सब्सट्रेट (जैव रसायन), जैव रसायन रिसेप्टर और लिगैंड (जैव रसायन), या प्रोटीन और न्यूक्लिक अम्ल [1] विभिन्न जैव अणुओं के अलगाव के लिए बाध्यकारी अंतःक्रियाओं का अक्सर उपयोग किया जाता है। आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी इसकी उच्च चयनात्मकता (क्रोमैटोग्राफी) और अलगाव के संकल्प (क्रोमैटोग्राफी) के लिए उपयोगी है,[2][3] अन्य क्रोमैटोग्राफिक विधियों की तुलना में।

सिद्धांत

आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी में रुचि के विश्लेषण (आमतौर पर मोबाइल चरण में भंग), और एक बाध्यकारी भागीदार या लिगैंड (स्थिर चरण (रसायन विज्ञान) पर स्थिर) के बीच विशिष्ट बाध्यकारी बातचीत का लाभ होता है। एक विशिष्ट आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी प्रयोग में, लिगैंड एक ठोस, अघुलनशील मैट्रिक्स से जुड़ा होता है - आमतौर पर एक बहुलक जैसे कि agarose या polyacrylamide - प्रतिक्रियाशील कार्यात्मक समूहों को पेश करने के लिए रासायनिक रूप से संशोधित किया जाता है जिसके साथ लिगैंड प्रतिक्रिया कर सकता है, जिससे स्थिर सहसंयोजक बंधन बनते हैं।[4] स्थिर चरण को पहले एक कॉलम में लोड किया जाता है जिसमें मोबाइल चरण पेश किया जाता है। अणु जो लिगैंड से बंधते हैं, स्थिर चरण से जुड़े रहेंगे। उसके बाद स्थिर चरण के साथ उनकी कमजोर अंतःक्रियाओं को बाधित करके गैर-लक्षित जैव अणुओं को हटाने के लिए एक वॉश बफर लगाया जाता है, जबकि ब्याज के जैव अणु बाध्य रहेंगे। लक्ष्य बायोमोलेक्यूलस को एक तथाकथित रेफरेंस बफर लगाने से हटाया जा सकता है, जो बाध्य लक्ष्य बायोमोलेक्युलस और लिगैंड के बीच बातचीत को बाधित करता है। लक्ष्य अणु इस प्रकार eluting समाधान में पुनर्प्राप्त किया जाता है।[5]

एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी को आणविक भार, चार्ज, हाइड्रोफोबिसिटी, या रुचि के विश्लेषण के अन्य भौतिक गुणों की आवश्यकता नहीं होती है, हालांकि इसके बाध्यकारी गुणों का ज्ञान पृथक्करण प्रोटोकॉल के डिजाइन में उपयोगी होता है।[5]एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी प्रक्रियाओं में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले बाध्यकारी इंटरैक्शन के प्रकार नीचे दी गई तालिका में संक्षेप में दिए गए हैं।

Typical biological interactions used in affinity chromatography[6]
Sr. no Types of ligand Target molecule
1 Substrate analogue Enzymes
2 Antibody Antigen
3 Lectin Polysaccharide
4 Nucleic acid Complementary base sequence
5 Hormone Receptor
6 Avidin Biotin/Biotin-conjugated molecule
7 Calmodulin Calmodulin binding partner
8 Glutathione GST fusion protein
9 Protein A or Protein G Immunoglobulins
10 Nickel-NTA polyhistidine fusion protein


बैच और कॉलम सेटअप

आत्मीयता स्तंभ क्रोमैटोग्राफी का सिद्धांत
बैच क्रोमैटोग्राफी

कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा ठोस चरण के लिए बाध्यकारी प्राप्त किया जा सकता है जिससे ठोस माध्यम को कॉलम पर पैक किया जाता है, प्रारंभिक मिश्रण कॉलम के माध्यम से व्यवस्थित होने की अनुमति देता है, कॉलम के माध्यम से एक वॉश बफर चलाया जाता है और बाद में कॉलम पर लागू होने वाला रेफरेंस बफर और एकत्र किया जाता है। . ये कदम आमतौर पर परिवेश के दबाव में किए जाते हैं। वैकल्पिक रूप से, एक बैच उपचार का उपयोग करके बाध्यकारी प्राप्त किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एक बर्तन में ठोस चरण में प्रारंभिक मिश्रण जोड़कर, मिश्रण करना, ठोस चरण को अलग करना, तरल चरण को हटाना, धुलाई, पुन: सेंट्रीफ्यूगिंग, रेफरेंस बफर को जोड़ना, फिर से सेंट्रीफ्यूगिंग और एल्यूट को हटाना।

कभी-कभी एक संकर विधि का उपयोग किया जाता है जैसे कि बंधन बैच विधि द्वारा किया जाता है, लेकिन लक्ष्य अणु के साथ ठोस चरण एक स्तंभ पर पैक किया जाता है और स्तंभ पर धुलाई और क्षालन किया जाता है।

आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी में प्रयुक्त लिगेंड कार्बनिक और अकार्बनिक दोनों स्रोतों से प्राप्त किए जाते हैं। जैविक स्रोतों के उदाहरण सीरम प्रोटीन, लेक्टिन और एंटीबॉडी हैं। अकार्बनिक स्रोत मोरोनिक एसिड, मेटल चेलेट्स और ट्राइज़ीन डाई हैं।[7] एक तीसरी विधि, विस्तारित बिस्तर अवशोषण, जो ऊपर उल्लिखित दो विधियों के लाभों को जोड़ती है, को भी विकसित किया गया है। ठोस चरण के कणों को एक स्तंभ में रखा जाता है जहां तरल चरण को नीचे से पंप किया जाता है और ऊपर से बाहर निकल जाता है। कणों का गुरुत्वाकर्षण सुनिश्चित करता है कि ठोस चरण तरल चरण के साथ स्तंभ से बाहर नहीं निकलता है।

एफ़िनिटी कॉलम नमक सांद्रता, पीएच, पीआई, चार्ज और आयनिक शक्ति को सीधे बदलकर या ब्याज के कणों को हल करने के लिए ढाल के माध्यम से क्षालन हो सकता है।

हाल ही में, श्रृंखला में एक से अधिक स्तंभों को नियोजित करने वाले सेटअप विकसित किए गए हैं। सिंगल कॉलम सेटअप की तुलना में लाभ यह है कि राल सामग्री को पूरी तरह से लोड किया जा सकता है क्योंकि गैर-बाध्यकारी उत्पाद को सीधे ताजा कॉलम सामग्री के साथ लगातार कॉलम पर पारित किया जाता है। इन क्रोमैटोग्राफिक प्रक्रियाओं को आवधिक प्रति-वर्तमान क्रोमैटोग्राफी (पीसीसी) के रूप में जाना जाता है। उत्पादित उत्पाद की प्रति राल लागत इस प्रकार काफी कम हो सकती है। चूँकि एक कॉलम हमेशा दूसरे कॉलम के लोड होने के दौरान विकसित और पुनर्जीवित किया जा सकता है, पहले से ही दो कॉलम फायदे का पूरा उपयोग करने के लिए पर्याप्त हैं।[8] अतिरिक्त कॉलम अतिरिक्त उपकरणों और राल लागतों की कीमत पर, क्षालन और पुनर्जनन समय के लिए अतिरिक्त लचीलापन दे सकते हैं।

विशिष्ट उपयोग

एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी का उपयोग न्यूक्लिक एसिड शुद्धि, प्रोटीन शुद्धि सहित कई अनुप्रयोगों में किया जा सकता है[9] सेल मुक्त अर्क से, और रक्त से शुद्धिकरण।

एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके, कोई प्रोटीन अलग कर सकता है जो प्रोटीन से एक निश्चित टुकड़े को बांधता है जो उस विशिष्ट टुकड़े को बांधता नहीं है।[10] क्योंकि शुद्धिकरण की यह तकनीक आवश्यक प्रोटीन के जैविक गुणों पर निर्भर करती है, यह एक उपयोगी तकनीक है और प्रोटीन को एक चरण में कई गुना शुद्ध किया जा सकता है।[11]

विभिन्न आत्मीयता मीडिया

विभिन्न प्रकार के संभावित उपयोगों के लिए कई अलग-अलग एफ़िनिटी मीडिया मौजूद हैं।[12][13][14] संक्षेप में, वे (सामान्यीकृत) सक्रिय/कार्यात्मक हैं जो एक कार्यात्मक स्पेसर के रूप में काम करते हैं, मैट्रिक्स का समर्थन करते हैं, और जहरीले अभिकर्मकों को संभालने को समाप्त करते हैं।

अमीनो एसिड मीडिया का उपयोग विभिन्न प्रकार के सीरम प्रोटीन, प्रोटीन, पेप्टाइड्स और एंजाइमों के साथ-साथ rRNA और dsDNA के साथ किया जाता है। एविडिन बायोटिन मीडिया का उपयोग बायोटिन/एविडिन और उनके डेरिवेटिव की शुद्धिकरण प्रक्रिया में किया जाता है।

कार्बोहाइड्रेट बॉन्डिंग का उपयोग अक्सर ग्लाइकोप्रोटीन या किसी अन्य कार्बोहाइड्रेट युक्त पदार्थ के साथ किया जाता है; कार्बोहाइड्रेट का उपयोग लेक्टिन, ग्लाइकोप्रोटीन या किसी अन्य कार्बोहाइड्रेट मेटाबोलाइट प्रोटीन के साथ किया जाता है। डाई-लिगैंड एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी विशिष्ट नहीं है लेकिन जैविक सबस्ट्रेट्स और प्रोटीन की नकल करती है। ग्लूटाथियोन जीएसटी टैग किए गए पुनः संयोजक प्रोटीन को अलग करने के लिए उपयोगी है। हेपरिन एक सामान्यीकृत एफ़िनिटी लिगैंड है, और यह न्यूक्लिक एसिड एंजाइम और लाइपेस के साथ प्लाज्मा जमावट प्रोटीन को अलग करने के लिए सबसे उपयोगी है।

हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन मीडिया का उपयोग आमतौर पर मुक्त कार्बोक्सिल समूहों और प्रोटीनों को लक्षित करने के लिए किया जाता है।

इम्यूनोफिनिटी मीडिया (नीचे विस्तृत) अलग करने के लिए एंटीजन और एंटीबॉडी की उच्च विशिष्टता का उपयोग करता है; स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी नीचे विस्तृत है और अलग करने के लिए धातु आयनों और प्रोटीन (आमतौर पर विशेष रूप से टैग) के बीच बातचीत का उपयोग करती है; न्यूक्लियोटाइड / कोएंजाइम जो डिहाइड्रोजनेज, किनेसेस और ट्रांसएमिनेस को अलग करने का काम करता है।

न्यूक्लिक एसिड एमआरएनए, डीएनए, आरआरएनए और अन्य न्यूक्लिक एसिड/ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को फंसाने का काम करते हैं। इम्यूनोग्लोबुलिन को शुद्ध करने के लिए प्रोटीन ए/जी विधि का उपयोग किया जाता है।

स्पेशलिटी मीडिया को एक विशिष्ट वर्ग या प्रकार के प्रोटीन / सह एंजाइम के लिए डिज़ाइन किया गया है; इस प्रकार का मीडिया केवल एक विशिष्ट प्रोटीन या कोएंजाइम को अलग करने का काम करेगा।

इम्यूनोफिनिटी

प्रक्रिया के लिए एक अन्य उपयोग रक्त सीरम से एंटीबॉडी की आत्मीयता शुद्धि है। यदि सीरम में एक विशिष्ट एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी होने के लिए जाना जाता है (उदाहरण के लिए यदि सीरम संबंधित एंटीजन के खिलाफ प्रतिरक्षित जीव से आता है) तो इसका उपयोग उस एंटीजन की एफ़िनिटी शुद्धि के लिए किया जा सकता है। इसे इम्यूनोफिनिटी क्रोमैटोग्राफी के रूप में भी जाना जाता है। उदाहरण के लिए, यदि किसी जीव को जीएसटी-संलयन प्रोटीन के खिलाफ प्रतिरक्षित किया जाता है, तो यह संलयन-प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उत्पादन करेगा, और संभवतः जीएसटी टैग के खिलाफ भी एंटीबॉडी का उत्पादन करेगा। फिर प्रोटीन को सहसंयोजक के रूप में एक ठोस समर्थन जैसे agarose के साथ जोड़ा जा सकता है और प्रतिरक्षा सीरम से एंटीबॉडी के शुद्धिकरण में एक आत्मीयता लिगैंड के रूप में उपयोग किया जाता है।

संपूर्णता के लिए, जीएसटी प्रोटीन और जीएसटी-फ्यूजन प्रोटीन प्रत्येक को अलग-अलग युग्मित किया जा सकता है। सीरम को शुरू में GST एफ़िनिटी मैट्रिक्स से बाइंड करने की अनुमति है। यह फ्यूजन प्रोटीन के जीएसटी भाग के खिलाफ एंटीबॉडी को हटा देगा। सीरम को फिर ठोस समर्थन से अलग किया जाता है और जीएसटी-संलयन प्रोटीन मैट्रिक्स से जुड़ने की अनुमति दी जाती है। यह किसी भी एंटीबॉडी को ठोस समर्थन पर कब्जा करने की अनुमति देता है जो एंटीजन को पहचानता है। ब्याज के एंटीबॉडी का सावधानी अक्सर कम पीएच बफर जैसे ग्लाइसिन पीएच 2.8 का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। कम पीएच रेफरेंस बफर को बेअसर करने और एंटीबॉडी की गतिविधि के किसी भी गिरावट को रोकने के लिए एल्यूएट को एक तटस्थ ट्रिस या फॉस्फेट बफर में एकत्र किया जाता है। यह एक अच्छा उदाहरण है क्योंकि प्रारंभिक जीएसटी-संलयन प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए आत्मीयता शुद्धि का उपयोग किया जाता है, सीरम से अवांछनीय एंटी-जीएसटी एंटीबॉडी को हटाने और लक्ष्य एंटीबॉडी को शुद्ध करने के लिए।

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का चयन प्रोटीन को बड़ी विशिष्टता के साथ बाँधने के लिए भी किया जा सकता है, जहाँ प्रोटीन काफी कोमल परिस्थितियों में जारी होता है। यह भविष्य में आगे के शोध के लिए उपयोगी हो सकता है।[15] पेप्टाइड प्रतिजनों के खिलाफ उत्पन्न एंटीबॉडी को शुद्ध करने के लिए अक्सर एक सरलीकृत रणनीति का उपयोग किया जाता है। जब पेप्टाइड प्रतिजनों को कृत्रिम रूप से उत्पादित किया जाता है, तो पेप्टाइड के एन- या सी-टर्मिनस में एक टर्मिनल सिस्टीन अवशेष जोड़ा जाता है। इस सिस्टीन अवशेषों में एक सल्फहाइड्रील कार्यात्मक समूह होता है जो पेप्टाइड को एक वाहक प्रोटीन (जैसे कीहोल लिम्पेट हेमोसायनिन (KLH)) के साथ आसानी से संयुग्मित होने की अनुमति देता है। उसी सिस्टीन युक्त पेप्टाइड को सिस्टीन अवशेषों के माध्यम से एक agarose राल पर भी स्थिर किया जाता है और फिर एंटीबॉडी को शुद्ध करने के लिए उपयोग किया जाता है।

बैक्टीरिया से प्राप्त इम्युनोग्लोबुलिन-विशिष्ट प्रोटीन ए या प्रोटीन जी पर आधारित एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके अधिकांश मोनोक्लोनल ऐंटीबॉडी को शुद्ध किया गया है।[16] ईवीएस की सतह पर पाए जाने वाले टेट्रास्पैनिन और इंटीग्रिन को लक्षित करके मानव रक्त प्लाज्मा से बाह्य पुटिकाओं (जैसे, एक्सोसोम और एक्सोमर्स) को पकड़ने के लिए मोनोलिथिक कॉलम पर स्थिर मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफिनिटी क्रोमैटोग्राफी का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है।[17][18] इम्यूनोफिनिटी क्रोमैटोग्राफी भी इम्यूनोक्रोमैटोग्राफिक टेस्ट (आईसीटी) स्ट्रिप्स का आधार है, जो रोगी देखभाल में निदान का एक तेज़ साधन प्रदान करता है। आईसीटी का उपयोग करते हुए, एक तकनीशियन किसी प्रयोगशाला की आवश्यकता के बिना रोगी के बिस्तर के पास निर्धारण कर सकता है।[19] आईसीटी पहचान एक संक्रमण पैदा करने वाले सूक्ष्म जीव के लिए अत्यधिक विशिष्ट है।[20]


स्थिर धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी

इमोबिलाइज्ड मेटल आयन एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी (IMAC) धातुओं के लिए अमीनो एसिड, विशेष रूप से हिस्टिडाइन के विशिष्ट समन्वय सहसंयोजक बंधन पर आधारित है। यह तकनीक हिस्टिडाइन युक्त प्रोटीन या पेप्टाइड्स, लोहा, जस्ता या गैलियम की शुद्धि के लिए कोबाल्ट, निकल, या तांबे जैसे स्थिर धातु आयनों वाले स्तंभ में धातु आयनों के लिए एक आत्मीयता के साथ प्रोटीन को बनाए रखने की अनुमति देकर काम करती है। फॉस्फोराइलेटेड प्रोटीन या पेप्टाइड्स की। प्राकृतिक रूप से पाए जाने वाले कई प्रोटीनों में धातु आयनों के लिए कोई बंधन नहीं होता है, इसलिए संबंधित जीन में ऐसे प्रोटीन टैग को पेश करने के लिए पुनः संयोजक डीएनए तकनीक का उपयोग किया जा सकता है। रुचि के प्रोटीन को एल्युशन करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों में पीएच को बदलना, या imidazole जैसे प्रतिस्पर्धी अणु को जोड़ना शामिल है।[21][22]

हिस्टीडाइन टैग के साथ प्रोटीन के शुद्धिकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले निकेल-अग्रोस मोतियों वाला एक क्रोमैटोग्राफी कॉलम
See also: Polyhistidine-tag

पुनः संयोजक प्रोटीन

संभवतः एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी का सबसे आम उपयोग पुनः संयोजक प्रोटीन की शुद्धि के लिए है। एक ज्ञात आत्मीयता वाले प्रोटीनों को उनके शुद्धिकरण में सहायता के लिए प्रोटीन दिवस किया जाता है। प्रोटीन को आनुवंशिक रूप से संशोधित किया गया हो सकता है ताकि इसे एफ़िनिटी बाइंडिंग के लिए चुना जा सके; इसे फ्यूजन प्रोटीन के रूप में जाना जाता है। प्रोटीन टैग में हेक्साहिस्टिडाइन (हिस्टिडाइन), ग्लूटेथिओन -एस-ट्रांसफरेज़ (जीएसटी) और माल्टोज़ बाइंडिंग प्रोटीन (एमबीपी) शामिल हैं। हिस्टडीन टैग में निकल, कोबाल्ट, जस्ता, तांबा और लोहे के आयनों के लिए एक समानता है, जो स्थिर चरण में शामिल एक चेलेटर के साथ समन्वित सहसंयोजक बांड बनाकर स्थिर हो गए हैं। क्षालन के लिए, धातु आयन लिगैंड के रूप में कार्य करने में सक्षम यौगिक की एक अतिरिक्त मात्रा, जैसे कि इमिडाज़ोल, का उपयोग किया जाता है। जीएसटी में ग्लूटाथियोन के लिए एक आकर्षण है जो व्यावसायिक रूप से ग्लूटाथियोन एग्रोज के रूप में स्थिर रूप से उपलब्ध है। रेफरेंस के दौरान, टैग किए गए प्रोटीन को विस्थापित करने के लिए अतिरिक्त ग्लूटाथियोन का उपयोग किया जाता है।

लेक्टिंस

लेक्टिन एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी का एक रूप है जहां लेक्टिन का उपयोग नमूने के भीतर घटकों को अलग करने के लिए किया जाता है। लेक्टिंस, जैसे कि कोंकनावेलिन ए, प्रोटीन हैं जो विशिष्ट अल्फा-डी-मेननोज और अल्फा-डी-ग्लूकोज कार्बोहाइड्रेट अणुओं को बांध सकते हैं। कुछ सामान्य कार्बोहाइड्रेट अणु जिनका उपयोग लेक्टिन एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी में किया जाता है, कॉन ए-सेफ़रोज़ और डब्ल्यूजीए-एग्रोज़ हैं।[23] लेक्टिन का एक अन्य उदाहरण गेहूं रोगाणु एग्लूटीनिन है जो डी-एन-एसिटाइल-ग्लूकोसामाइन को बांधता है।[24] सबसे आम अनुप्रयोग ग्लाइकोप्रोटीन को गैर-ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन से अलग करना है, या एक ग्लाइकोफ़ॉर्म को दूसरे ग्लाइकोफ़ॉर्म से अलग करना है।[25] हालांकि लेक्टिन एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी करने के कई तरीके हैं, लक्ष्य वांछित प्रोटीन का एक चीनी लिगैंड निकालना है।[23]


विशेषता

एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी के लिए एक अन्य उपयोग एक जेल मैट्रिक्स का उपयोग करके विशिष्ट प्रोटीन का शुद्धिकरण है जो एक विशिष्ट प्रोटीन के लिए अद्वितीय है। उदाहरण के लिए, ई. कोलाई β-galactosidase का शुद्धिकरण एफ़िनिटी मैट्रिक्स के रूप में p-aminobenyl-1-thio-β-D-galactopyranosyl agarose का उपयोग करके एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी द्वारा पूरा किया जाता है। p-aminobenyl-1-thio-β-D-galactopyranosyl agarose का उपयोग एफ़िनिटी मैट्रिक्स के रूप में किया जाता है क्योंकि इसमें गैलेक्टोपाइरानोसिल समूह होता है, जो ई. कोलाई β-Galactosidase के लिए एक अच्छे सब्सट्रेट एनालॉग के रूप में कार्य करता है। यह संपत्ति एंजाइम को एफ़िनिटी मैट्रिक्स के स्थिर चरण से बाँधने की अनुमति देती है और कॉलम में नमक की बढ़ती सांद्रता जोड़कर β-गैलेक्टोसिडेस को अलग किया जाता है।[26]


क्षारीय फॉस्फेट

ई. कोलाई से क्षारीय फॉस्फेट को डीईएई-सेल्यूलोज मैट्रिक्स का उपयोग करके शुद्ध किया जा सकता है। A. फॉस्फेट में हल्का ऋणात्मक आवेश होता है, जो इसे मैट्रिक्स में धनात्मक रूप से आवेशित अमाइन समूहों को कमजोर रूप से बाँधने की अनुमति देता है। फिर उच्च नमक सांद्रता वाले बफर को जोड़कर एंजाइम को बाहर निकाला जा सकता है।[27]


बोरोनेट आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी

बोरोनेट आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी में ग्लाइकोप्रोटीन की मात्रा को कम करने और मापने के लिए बोरोनिक एसिड या बोरोनेट का उपयोग होता है। ग्लाइकेटेड हीमोग्लोबिन #माप के माध्यम से मधुमेह रोगियों के दीर्घकालिक मूल्यांकन के निर्धारण में उपयोग के लिए नैदानिक ​​अनुकूलन ने इस प्रकार की क्रोमैटोग्राफी को लागू किया है।[24]


सीरम एल्बुमिन शुद्धि

एल्ब्यूमिन और मैक्रोग्लोबुलिन संदूषण की आत्मीयता शुद्धि अतिरिक्त एल्ब्यूमिन और α को हटाने में सहायक है2-मैक्रोग्लोबुलिन संदूषण, मास स्पेक्ट्रोमेट्री करते समय। सीरम एल्ब्यूमिन की आत्मीयता शुद्धि में, सीरम प्रोटीन को इकट्ठा करने या आकर्षित करने के लिए उपयोग की जाने वाली स्थिर सिबैक्रोन ब्लू-सेफ़रोज़ हो सकती है। तब सीरम प्रोटीन को thiocyanate (एससीएन) युक्त बफर के साथ सोखने वाले पदार्थ से निकाला जा सकता है-).[28]


कमजोर आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी

कमजोर आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी[29] (डब्ल्यूएसी) औषध विकास में एफ़िनिटी स्क्रीनिंग के लिए एक एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी तकनीक है।[30][31] WAC एक आत्मीयता-आधारित क्रोमैटोग्राफी तकनीक है जो रासायनिक यौगिकों को उनके अलग-अलग कमजोर बंधुताओं के आधार पर स्थिर लक्ष्य से अलग करती है। किसी कंपाउंड का लक्ष्य के प्रति जितना अधिक जुड़ाव होता है, उतनी ही देर तक वह पृथक्करण इकाई में रहता है, और इसे लंबे अवधारण समय के रूप में व्यक्त किया जाएगा। विश्लेषण किए गए यौगिकों के प्राप्त प्रतिधारण समय को संसाधित करके आत्मीयता माप और आत्मीयता की रैंकिंग प्राप्त की जा सकती है। एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी chemoproteomics आधारित दवा लक्ष्य पहचान में उपयोग की जाने वाली तकनीकों के एक बड़े सूट का हिस्सा है।

WAC तकनीक को कई अलग-अलग प्रोटीन लक्ष्यों - प्रोटीज, काइनेज, चैपरोन (प्रोटीन) और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन (PPI) लक्ष्य के विरुद्ध प्रदर्शित किया जाता है। खंड आधारित स्क्रीनिंग के लिए स्थापित तरीकों की तुलना में WAC को अधिक प्रभावी दिखाया गया है।[31]


इतिहास

एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी की कल्पना की गई थी और सबसे पहले पेड्रो क्वाट्रेकास और मीर विल्चेक द्वारा विकसित की गई थी।[32][33]


संदर्भ

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