पूरक डीएनए: Difference between revisions

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=== आरएनए शुद्धि ===
=== आरएनए शुद्धि ===
आरएनए को होस्ट कोशिकाओं में जीनोमिक डीएनए से लिया जाता है और पहले लिसिंग कोशिकाओं द्वारा निकाला जाता है, फिर फेनोल-क्लोरोफॉर्म, सिलिका कॉलम और बीएड-आधारित आरएनए निष्कर्षण तरीकों जैसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीकों का उपयोग करके आरएनए को शुद्ध किया जाता है।<ref>{{Cite journal|last1=Tavares|first1=Lucélia|last2=Alves|first2=Paula M.|last3=Ferreira|first3=Ricardo B.|last4=Santos|first4=Claudia N.|date=6 January 2011|title=एसके-एन-एमसी न्यूरोब्लास्टोमा से डीएनए मुक्त आरएनए अलगाव के लिए विभिन्न तरीकों की तुलना|journal=BMC Research Notes|volume=4|issue=1|pages=3|doi=10.1186/1756-0500-4-3|issn=1756-0500|pmc=3050700|pmid=21211020}}</ref> निष्कर्षण विधि स्रोत सामग्री के आधार पर भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, पौधे के ऊतकों से आरएनए को निकालने के लिए अतिरिक्त अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, जैसे पॉलीविनाइलपिरॉलिडोन (पीवीपी), फेनोलिक यौगिकों, कार्बोहाइड्रेट और अन्य यौगिकों को हटाने के लिए जो अन्यथा आरएनए को असामान्य बना देंगे।<ref>{{cite journal|title=पॉलीफेनोल्स और पॉलीसेकेराइड रिच प्लांट टिश्यू से आरएनए अलगाव की बेहतर और सुविधाजनक विधि|last1=R|first1=Kansal|last2=K|first2=Kuhar|date=December 2008|language=en|pmid=19245182|last3=I|first3=Verma|last4=Rn|first4=Gupta|last5=Vk|first5=Gupta|last6=Kr|first6=Koundal|journal=Indian Journal of Experimental Biology|volume=46|issue=12|pages=842–5}}</ref> डीएनए और प्रोटीन को हटाने के लिए, डीनेज और प्रोटीनस के रूप में एंजाइम का उपयोग क्षरण के लिए किया जाता है।<ref>{{Cite journal|title=आरएनए शुद्धिकरण के तरीके। सभी तरीके (चाहिए) रोम की ओर ले जाते हैं|last1=I|first1=Vomelová|last2=Z|first2=Vanícková|date=2009|language=en|pmid=20163774|last3=A|first3=Sedo|journal=Folia Biologica|volume=55|issue=6|pages=243–51}}</ref> महत्वपूर्ण विषय है, आरएनए अखंडता को कैनोट्रोपिक प्रतिरूपकों जैसे कि गुएनिडियम आइसोथियोसाइनेट, सोडियम डोडसाइल सल्फेट (एसडीएस), फेनोल या क्लोरोफॉर्म के साथ निष्क्रिय करके बनाए रखा जाता है। इसके बाद कुल आरएनए को अन्य सेलुलर घटकों से अलग कर दिया जाता है और शराब के साथ उत्पन्न किया जाता है। विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए सरल और त्वरित आरएनए निष्कर्षण के लिए विभिन्न वाणिज्यिक किट मौजूद हैं।<ref>{{Cite journal|last1=Sellin Jeffries|first1=Marlo K.|last2=Kiss|first2=Andor J.|last3=Smith|first3=Austin W.|last4=Oris|first4=James T.|date=14 November 2014|title=छोटे ऊतक नमूनों से कुल आरएनए के अलगाव के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित और मैन्युअल निष्कर्षण किट की तुलना|journal=BMC Biotechnology|volume=14|issue=1|pages=94|doi=10.1186/s12896-014-0094-8|issn=1472-6750|pmc=4239376|pmid=25394494}}</ref> अतिरिक्त बीएड-आधारित तरीकों का उपयोग आरएनए के विशिष्ट उप-प्रकार को अलग करने के लिए किया जा सकता है... (जैसे कि एमआरएनए और माइक्रोआरएनए आकार या अद्वितीय आरएनए क्षेत्रों पर आधारित है।<ref>{{Cite web|title=mRNA Isolation with Dynabeads in 15 minutes - US|url=https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/dna-rna-purification-analysis/napamisc/mrna-isolation-dynabeads.html|website=www.thermofisher.com|language=en|access-date=20 May 2020}}</ref><ref>{{cite journal|last1=Gaarz|first1=Andrea|last2=Debey-Pascher|first2=Svenja|last3=Classen|first3=Sabine|last4=Eggle|first4=Daniela|last5=Gathof|first5=Birgit|last6=Chen|first6=Jing|last7=Fan|first7=Jian-Bing|last8=Voss|first8=Thorsten|last9=Schultze|first9=Joachim L.|last10=Staratschek-Jox|first10=Andrea|date=May 2010|title=Bead Array–Based microRNA Expression Profiling of Peripheral Blood and the Impact of Different RNA Isolation Approaches|journal=The Journal of Molecular Diagnostics |volume=12|issue=3|pages=335–344|doi=10.2353/jmoldx.2010.090116|issn=1525-1578|pmc=2860470|pmid=20228267}}</ref>
आरएनए को होस्ट कोशिकाओं में जीनोमिक डीएनए से लिया जाता है और पहले लिसिंग कोशिकाओं द्वारा निकाला जाता है, फिर फेनोल-क्लोरोफॉर्म, सिलिका कॉलम और बीएड-आधारित आरएनए निष्कर्षण तरीकों जैसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीकों का उपयोग करके आरएनए को शुद्ध किया जाता है।<ref>{{Cite journal|last1=Tavares|first1=Lucélia|last2=Alves|first2=Paula M.|last3=Ferreira|first3=Ricardo B.|last4=Santos|first4=Claudia N.|date=6 January 2011|title=एसके-एन-एमसी न्यूरोब्लास्टोमा से डीएनए मुक्त आरएनए अलगाव के लिए विभिन्न तरीकों की तुलना|journal=BMC Research Notes|volume=4|issue=1|pages=3|doi=10.1186/1756-0500-4-3|issn=1756-0500|pmc=3050700|pmid=21211020}}</ref> निष्कर्षण विधि स्रोत सामग्री के आधार पर भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, पौधे के ऊतकों से आरएनए को निकालने के लिए अतिरिक्त अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, जैसे पॉलीविनाइलपिरॉलिडोन (पीवीपी), फेनोलिक यौगिकों, कार्बोहाइड्रेट और अन्य यौगिकों को हटाने के लिए जो अन्यथा आरएनए को असामान्य बना देंगे।<ref>{{cite journal|title=पॉलीफेनोल्स और पॉलीसेकेराइड रिच प्लांट टिश्यू से आरएनए अलगाव की बेहतर और सुविधाजनक विधि|last1=R|first1=Kansal|last2=K|first2=Kuhar|date=December 2008|language=en|pmid=19245182|last3=I|first3=Verma|last4=Rn|first4=Gupta|last5=Vk|first5=Gupta|last6=Kr|first6=Koundal|journal=Indian Journal of Experimental Biology|volume=46|issue=12|pages=842–5}}</ref> डीएनए और प्रोटीन को हटाने के लिए, डीनेज और प्रोटीनस के रूप में एंजाइम का उपयोग क्षरण के लिए किया जाता है।<ref>{{Cite journal|title=आरएनए शुद्धिकरण के तरीके। सभी तरीके (चाहिए) रोम की ओर ले जाते हैं|last1=I|first1=Vomelová|last2=Z|first2=Vanícková|date=2009|language=en|pmid=20163774|last3=A|first3=Sedo|journal=Folia Biologica|volume=55|issue=6|pages=243–51}}</ref> महत्वपूर्ण विषय है, आरएनए अखंडता को कैनोट्रोपिक प्रतिरूपकों जैसे कि गुएनिडियम आइसोथियोसाइनेट, सोडियम डोडसाइल सल्फेट (एसडीएस), फेनोल या क्लोरोफॉर्म के साथ निष्क्रिय करके बनाए रखा जाता है। इसके बाद कुल आरएनए को अन्य सेलुलर घटकों से अलग कर दिया जाता है और शराब के साथ उत्पन्न किया जाता है। विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए सरल और त्वरित आरएनए निष्कर्षण के लिए विभिन्न वाणिज्यिक किट मौजूद हैं।<ref>{{Cite journal|last1=Sellin Jeffries|first1=Marlo K.|last2=Kiss|first2=Andor J.|last3=Smith|first3=Austin W.|last4=Oris|first4=James T.|date=14 November 2014|title=छोटे ऊतक नमूनों से कुल आरएनए के अलगाव के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित और मैन्युअल निष्कर्षण किट की तुलना|journal=BMC Biotechnology|volume=14|issue=1|pages=94|doi=10.1186/s12896-014-0094-8|issn=1472-6750|pmc=4239376|pmid=25394494}}</ref> अतिरिक्त बीएड-आधारित तरीकों का उपयोग आरएनए के विशिष्ट उप-प्रकार को अलग करने के लिए किया जा सकता है... (जैसे कि एमआरएनए और माइक्रोआरएनए आकार या अद्वितीय आरएनए क्षेत्रों पर आधारित है।<ref>{{Cite web|title=mRNA Isolation with Dynabeads in 15 minutes - US|url=https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/dna-rna-purification-analysis/napamisc/mrna-isolation-dynabeads.html|website=www.thermofisher.com|language=en|access-date=20 May 2020}}</ref><ref>{{cite journal|last1=Gaarz|first1=Andrea|last2=Debey-Pascher|first2=Svenja|last3=Classen|first3=Sabine|last4=Eggle|first4=Daniela|last5=Gathof|first5=Birgit|last6=Chen|first6=Jing|last7=Fan|first7=Jian-Bing|last8=Voss|first8=Thorsten|last9=Schultze|first9=Joachim L.|last10=Staratschek-Jox|first10=Andrea|date=May 2010|title=Bead Array–Based microRNA Expression Profiling of Peripheral Blood and the Impact of Different RNA Isolation Approaches|journal=The Journal of Molecular Diagnostics |volume=12|issue=3|pages=335–344|doi=10.2353/jmoldx.2010.090116|issn=1525-1578|pmc=2860470|pmid=20228267}}</ref>
=== रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन ===
=== विपरीत प्रतिलेखन ===
 
==== प्रथम-किनारा संश्लेषण ====
एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एंजाइम और शुद्ध आरएनए टेम्पलेट्स का उपयोग करके, सीडीएनए का एक स्ट्रैंड तैयार किया जाता है (प्रथम-स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण)। मोलोनी मुराइन ल्यूकेमिया वायरस से एम-एमएलवी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग आमतौर पर लंबे समय तक आरएनए के ट्रांसक्रिप्शन के लिए उपयुक्त [[राइबोन्यूक्लिएज एच]] गतिविधि में कमी के कारण किया जाता है।<ref>{{Citation|last1=Haddad|first1=Fadia|title=Reverse Transcription of the Ribonucleic Acid: The First Step in RT-PCR Assay|date=2010|work=RT-PCR Protocols: Second Edition|pages=261–270|editor-last=King|editor-first=Nicola|series=Methods in Molecular Biology|publisher=Humana Press|language=en|doi=10.1007/978-1-60761-629-0_17|isbn=978-1-60761-629-0|last2=Baldwin|first2=Kenneth M.|volume=630|pmid=20301003}}</ref> एवियन मायलोब्लास्टोसिस वायरस से एएमवी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग आरएनए टेम्पलेट्स के लिए मजबूत माध्यमिक संरचनाओं (यानी उच्च पिघलने वाले तापमान) के साथ भी किया जा सकता है।<ref>{{cite web|title=रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और सीडीएनए अवलोकन और अनुप्रयोग|url=https://www.goldbio.com/articles/article/Reverse-Transcriptase-cDNA-Overview-Applications|last=Martin|first=Karen|website=Gold Biotechnology|access-date=20 May 2020}}</ref> सीडीएनए आमतौर पर एमआरएनए से जीन एक्सप्रेशन एनालिसिस जैसे रियल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन | आरटी-क्यूपीसीआर और आरएनए-सेक | आरएनए-सीक के लिए उत्पन्न होता है।<ref>{{Cite web|title=qPCR, Microarrays or RNA Sequencing - What to Choose?|url=https://www.biosistemika.com/blog/qpcr-microarrays-rna-sequencing-choose-one/|date=10 August 2017|website=BioSistemika|language=en-US|access-date=20 May 2020}}</ref> एमआरएनए ऑलिगो-डी [[थाइमिन]] प्राइमरों का उपयोग करके चुनिंदा रूप से रिवर्स ट्रांसकोड किया गया है जो [[पॉलीएडेनाइलेशन]] के रिवर्स पूरक हैं। सभी एमआरएनए के 3' छोर पर पॉली-एडिनाइलेटेड टेल। ओलिगो-डीटी और यादृच्छिक हेक्सामेर प्राइमरों का एक अनुकूलित मिश्रण 5' या 3' पूर्वाग्रह को कम करते हुए पूर्ण लंबाई सीडीएनए प्राप्त करने का मौका बढ़ाता है।<ref>{{Cite web|title=cDNA Synthesis {{!}} Bio-Rad|url=https://www.bio-rad.com/featured/en/cdna-synthesis.html|website=www.bio-rad.com|access-date=28 May 2020}}</ref> [[राइबोसोमल आरएनए]] भी कुछ [[गैर-कोडिंग आरएनए]] जैसे एमआरएनए और गैर-पॉली-एडिनिलेटेड ट्रांसक्रिप्ट दोनों को समृद्ध करने के लिए समाप्त हो सकता है।<ref>{{Cite journal|last1=Herbert|first1=Zachary T.|last2=Kershner|first2=Jamie P.|last3=Butty|first3=Vincent L.|last4=Thimmapuram|first4=Jyothi|last5=Choudhari|first5=Sulbha|last6=Alekseyev|first6=Yuriy O.|last7=Fan|first7=Jun|last8=Podnar|first8=Jessica W.|last9=Wilcox|first9=Edward|last10=Gipson|first10=Jenny|last11=Gillaspy|first11=Allison|date=15 March 2018|title=इल्लुमिना RNAseq पुस्तकालय निर्माण के लिए राइबोसोमल डिप्लेशन किट की क्रॉस-साइट तुलना|journal=BMC Genomics|volume=19|issue=1|pages=199|doi=10.1186/s12864-018-4585-1|issn=1471-2164|pmc=6389247|pmid=29703133}}</ref>
 


==== प्रथम-चरण संश्लेषण ====
विपरीत प्रतिलेखन एंजाइम और शुद्ध आरएनए टेम्प्लेट का उपयोग करके, सीडीएनए का एक स्ट्रैंड उत्पन्न किया जाता है (प्रथम-स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण)। मोलोनी मुराइन ल्यूकेमिया वायरस से एम-एमएलवी विपरीत प्रतिलेखन का उपयोग आमतौर पर इसकी कम आरएनएएस एच गतिविधि के कारण किया जाता है जो लंबे आरएनए के ट्रांसक्रिप्शन के लिए अनुकूल है।<ref>{{Citation|last1=Haddad|first1=Fadia|title=Reverse Transcription of the Ribonucleic Acid: The First Step in RT-PCR Assay|date=2010|work=RT-PCR Protocols: Second Edition|pages=261–270|editor-last=King|editor-first=Nicola|series=Methods in Molecular Biology|publisher=Humana Press|language=en|doi=10.1007/978-1-60761-629-0_17|isbn=978-1-60761-629-0|last2=Baldwin|first2=Kenneth M.|volume=630|pmid=20301003}}</ref> एवियन मायलोब्लास्टोसिस वायरस से प्राप्त एएमवी विपरीत प्रतिलेखन का उपयोग मजबूत माध्यमिक संरचनाओं (यानी उच्च पिघलने वाले तापमान) वाले आरएनए टेम्पलेट्स के लिए भी किया जा सकता है।<ref>{{cite web|title=रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और सीडीएनए अवलोकन और अनुप्रयोग|url=https://www.goldbio.com/articles/article/Reverse-Transcriptase-cDNA-Overview-Applications|last=Martin|first=Karen|website=Gold Biotechnology|access-date=20 May 2020}}</ref> सीडीएनए आमतौर पर आरटी-क्यूपीसीआर और आरएनए-सीक्यू जैसे जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एमआरएनए से उत्पन्न होता है।<ref>{{Cite web|title=qPCR, Microarrays or RNA Sequencing - What to Choose?|url=https://www.biosistemika.com/blog/qpcr-microarrays-rna-sequencing-choose-one/|date=10 August 2017|website=BioSistemika|language=en-US|access-date=20 May 2020}}</ref> एमआरएनए को ऑलिगो-डीटी प्राइमरों का उपयोग करके चुनिंदा रूप से रिवर्स ट्रांसक्राइब किया जाता है, जो सभी एमआरएनए के 3' सिरे पर पॉली-एडिनाइलेटेड टेल के रिवर्स पूरक हैं। ऑलिगो-डीटी और रैंडम हेक्सामर प्राइमरों का एक अनुकूलित मिश्रण 5' या 3' पूर्वाग्रह को कम करते हुए पूर्ण-लंबाई सीडीएनए प्राप्त करने की संभावना बढ़ाता है।<ref>{{Cite web|title=cDNA Synthesis {{!}} Bio-Rad|url=https://www.bio-rad.com/featured/en/cdna-synthesis.html|website=www.bio-rad.com|access-date=28 May 2020}}</ref> [[राइबोसोमल आरएनए]] भी एमआरएनए और गैर-पॉली-एडिनाइलेटेड ट्रांस्क्रिप्ट जैसे कुछ गैर-कोडिंग आरएनए को समृद्ध करने के लिए समाप्त हो सकता है।<ref>{{Cite journal|last1=Herbert|first1=Zachary T.|last2=Kershner|first2=Jamie P.|last3=Butty|first3=Vincent L.|last4=Thimmapuram|first4=Jyothi|last5=Choudhari|first5=Sulbha|last6=Alekseyev|first6=Yuriy O.|last7=Fan|first7=Jun|last8=Podnar|first8=Jessica W.|last9=Wilcox|first9=Edward|last10=Gipson|first10=Jenny|last11=Gillaspy|first11=Allison|date=15 March 2018|title=इल्लुमिना RNAseq पुस्तकालय निर्माण के लिए राइबोसोमल डिप्लेशन किट की क्रॉस-साइट तुलना|journal=BMC Genomics|volume=19|issue=1|pages=199|doi=10.1186/s12864-018-4585-1|issn=1471-2164|pmc=6389247|pmid=29703133}}</ref>
==== द्वितीय-किनारा संश्लेषण ====
==== द्वितीय-किनारा संश्लेषण ====
प्रथम-स्ट्रैंड सिंथेसिस, आरएनए-डीएनए हाइब्रिड का परिणाम, कई सेकंड-स्ट्रैंड सिंथेसिस विधियों के माध्यम से संसाधित किया जा सकता है या सीधे डाउनस्ट्रीम एसेज़ में संसाधित किया जा सकता है।<ref>{{cite web|title=सीडीएनए संश्लेषण प्रणाली|url=http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/18267.pdf |archive-url=https://web.archive.org/web/20181222122300/http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/18267.pdf |archive-date=2018-12-22 |url-status=live|last=Invitrogen|website=Thermofisher|access-date=27 May 2020}}</ref><ref>{{Cite journal|last1=Agarwal|first1=Saurabh|last2=Macfarlan|first2=Todd S.|last3=Sartor|first3=Maureen A.|last4=Iwase|first4=Shigeki|date=21 January 2015|title=फर्स्ट-स्ट्रैंड सीडीएनए लाइब्रेरी की सीक्वेंसिंग से फुल-लेंथ ट्रांसक्रिप्टोम का पता चलता है|journal=Nature Communications|language=en|volume=6|issue=1|page=6002|doi=10.1038/ncomms7002|pmid=25607527|pmc=5054741|bibcode=2015NatCo...6.6002A|issn=2041-1723}}</ref> हेयरपिन-प्राइमेड सिंथेसिस के रूप में जानी जाने वाली एक प्रारंभिक विधि प्रथम-स्ट्रैंड सीडीएनए के 3' छोर पर प्राइम सेकेंड-स्ट्रैंड सिंथेसिस पर हेयरपिन के गठन पर निर्भर करती है। हालाँकि, भड़काना यादृच्छिक है और हेयरपिन हाइड्रोलिसिस से जानकारी का नुकसान होता है। Gubler और हॉफमैन प्रक्रिया E. Coli RNase H का उपयोग mRNA को निकने के लिए करती है जिसे E. Coli DNA पोलीमरेज़ I I से बदल दिया जाता है और E. Coli [[DNA ligase]] के साथ सील कर दिया जाता है। इस प्रक्रिया का एक अनुकूलन M-MLV की निम्न RNase H गतिविधि पर निर्भर करता है ताकि शेष RNA के साथ निक mRNA को बाद में दूसरी-स्ट्रैंड cDNA के डीएनए पोलीमरेज़ अनुवाद के बाद RNase H जोड़कर हटा दिया जाए। यह mRNA के 5' छोर पर खोई हुई अनुक्रम सूचना को रोकता है।
प्रथम-स्ट्रैंड सिंथेसिस, आरएनए-डीएनए हाइब्रिड का परिणाम, कई सेकंड-स्ट्रैंड सिंथेसिस विधियों के माध्यम से संसाधित किया जा सकता है या सीधे डाउनस्ट्रीम एसेज़ में संसाधित किया जा सकता है।<ref>{{cite web|title=सीडीएनए संश्लेषण प्रणाली|url=http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/18267.pdf |archive-url=https://web.archive.org/web/20181222122300/http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/18267.pdf |archive-date=2018-12-22 |url-status=live|last=Invitrogen|website=Thermofisher|access-date=27 May 2020}}</ref><ref>{{Cite journal|last1=Agarwal|first1=Saurabh|last2=Macfarlan|first2=Todd S.|last3=Sartor|first3=Maureen A.|last4=Iwase|first4=Shigeki|date=21 January 2015|title=फर्स्ट-स्ट्रैंड सीडीएनए लाइब्रेरी की सीक्वेंसिंग से फुल-लेंथ ट्रांसक्रिप्टोम का पता चलता है|journal=Nature Communications|language=en|volume=6|issue=1|page=6002|doi=10.1038/ncomms7002|pmid=25607527|pmc=5054741|bibcode=2015NatCo...6.6002A|issn=2041-1723}}</ref> हेयरपिन-प्राइमेड सिंथेसिस के रूप में जानी जाने वाली एक प्रारंभिक विधि प्रथम-स्ट्रैंड सीडीएनए के 3' छोर पर प्राइम सेकेंड-स्ट्रैंड सिंथेसिस पर हेयरपिन के गठन पर निर्भर करती है। हालाँकि, भड़काना यादृच्छिक है और हेयरपिन हाइड्रोलिसिस से जानकारी का नुकसान होता है। Gubler और हॉफमैन प्रक्रिया E. Coli RNase H का उपयोग mRNA को निकने के लिए करती है जिसे E. Coli DNA पोलीमरेज़ I I से बदल दिया जाता है और E. Coli [[DNA ligase]] के साथ सील कर दिया जाता है। इस प्रक्रिया का एक अनुकूलन M-MLV की निम्न RNase H गतिविधि पर निर्भर करता है ताकि शेष RNA के साथ निक mRNA को बाद में दूसरी-स्ट्रैंड cDNA के डीएनए पोलीमरेज़ अनुवाद के बाद RNase H जोड़कर हटा दिया जाए। यह mRNA के 5' छोर पर खोई हुई अनुक्रम सूचना को रोकता है।
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कुछ वायरस अपने वायरल आरएनए को एमआरएनए (वायरल आरएनए → सीडीएनए → एमआरएनए) में बदलने के लिए सीडीएनए का भी उपयोग करते हैं। वायरल प्रोटीन को होस्ट सेल पर कब्जा करने के लिए एमआरएनए का उपयोग किया जाता है।
कुछ वायरस अपने वायरल आरएनए को एमआरएनए (वायरल आरएनए → सीडीएनए → एमआरएनए) में बदलने के लिए सीडीएनए का भी उपयोग करते हैं। वायरल प्रोटीन को होस्ट सेल पर कब्जा करने के लिए एमआरएनए का उपयोग किया जाता है।


वायरल आरएनए से सीडीएनए तक के इस पहले चरण का एक उदाहरण संक्रमण के एचआईवी चक्र में देखा जा सकता है। यहां, मेजबान कोशिका झिल्ली वायरस के लिपिड लिफाफे से जुड़ी होती है जो वायरल कैप्सिड को वायरल जीनोम आरएनए की दो प्रतियों के साथ मेजबान में प्रवेश करने की अनुमति देती है। फिर सीडीएनए की प्रतिलिपि वायरल आरएनए के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के माध्यम से बनाई जाती है, एक प्रक्रिया जिसे चैपरोन एसवाईपीए और एक वायरल कैप्सिड संबंधित रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस द्वारा सुगम बनाया जाता है।<ref>{{Cite journal|last1=Altfeld|first1=Marcus|last2=Gale|first2=Michael Jr.|date=1 June 2015|title=एचआईवी -1 संक्रमण के खिलाफ सहज प्रतिरक्षा|url=http://www.nature.com/ni/journal/v16/n6/box/ni.3157_BX1.html|journal=Nature Immunology|language=en|volume=16|issue=6|pages=554–562|doi=10.1038/ni.3157|pmid=25988887|s2cid=1577651|issn=1529-2908|doi-access=free}}</ref>
वायरल आरएनए से सीडीएनए तक के इस पहले चरण का एक उदाहरण संक्रमण के एचआईवी चक्र में देखा जा सकता है। यहां, मेजबान कोशिका झिल्ली वायरस के लिपिड लिफाफे से जुड़ी होती है जो वायरल कैप्सिड को वायरल जीनोम आरएनए की दो प्रतियों के साथ मेजबान में प्रवेश करने की अनुमति देती है। फिर सीडीएनए की प्रतिलिपि वायरल आरएनए के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के माध्यम से बनाई जाती है, एक प्रक्रिया जिसे चैपरोन एसवाईपीए और एक वायरल कैप्सिड संबंधित विपरीत प्रतिलेखन द्वारा सुगम बनाया जाता है।<ref>{{Cite journal|last1=Altfeld|first1=Marcus|last2=Gale|first2=Michael Jr.|date=1 June 2015|title=एचआईवी -1 संक्रमण के खिलाफ सहज प्रतिरक्षा|url=http://www.nature.com/ni/journal/v16/n6/box/ni.3157_BX1.html|journal=Nature Immunology|language=en|volume=16|issue=6|pages=554–562|doi=10.1038/ni.3157|pmid=25988887|s2cid=1577651|issn=1529-2908|doi-access=free}}</ref>
सीडीएनए यूकेरियोटिक जीनोम में [[रेट्रोट्रांसपोसन]] द्वारा भी उत्पन्न होता है। रेट्रोट्रांस्पॉन्स मोबाइल जेनेटिक तत्व हैं जो खुद को आरएनए इंटरमीडिएट के माध्यम से जीनोम के भीतर और कभी-कभी बीच में ले जाते हैं। यह तंत्र संक्रामक कणों की उत्पत्ति के बहिष्करण के साथ वायरस के साथ साझा किया जाता है।<ref>{{Cite journal|last1=Havecker|first1=Ericka R.|last2=Gao|first2=Xiang|last3=Voytas|first3=Daniel F.|date=2004-05-18|title=एलटीआर रेट्रोट्रांसपोंसन की विविधता|journal=Genome Biology|volume=5|issue=6|pages=225|doi=10.1186/gb-2004-5-6-225|issn=1474-760X|pmc=463057|pmid=15186483}}</ref><ref>{{Cite journal|last1=Cordaux|first1=Richard|last2=Batzer|first2=Mark A.|date=October 2009|title=मानव जीनोम के विकास पर रेट्रोट्रांस्पोन्स का प्रभाव|journal=Nature Reviews Genetics|language=en|volume=10|issue=10|pages=691–703|doi=10.1038/nrg2640|pmid=19763152|pmc=2884099|issn=1471-0064}}</ref>
सीडीएनए यूकेरियोटिक जीनोम में [[रेट्रोट्रांसपोसन]] द्वारा भी उत्पन्न होता है। रेट्रोट्रांस्पॉन्स मोबाइल जेनेटिक तत्व हैं जो खुद को आरएनए इंटरमीडिएट के माध्यम से जीनोम के भीतर और कभी-कभी बीच में ले जाते हैं। यह तंत्र संक्रामक कणों की उत्पत्ति के बहिष्करण के साथ वायरस के साथ साझा किया जाता है।<ref>{{Cite journal|last1=Havecker|first1=Ericka R.|last2=Gao|first2=Xiang|last3=Voytas|first3=Daniel F.|date=2004-05-18|title=एलटीआर रेट्रोट्रांसपोंसन की विविधता|journal=Genome Biology|volume=5|issue=6|pages=225|doi=10.1186/gb-2004-5-6-225|issn=1474-760X|pmc=463057|pmid=15186483}}</ref><ref>{{Cite journal|last1=Cordaux|first1=Richard|last2=Batzer|first2=Mark A.|date=October 2009|title=मानव जीनोम के विकास पर रेट्रोट्रांस्पोन्स का प्रभाव|journal=Nature Reviews Genetics|language=en|volume=10|issue=10|pages=691–703|doi=10.1038/nrg2640|pmid=19763152|pmc=2884099|issn=1471-0064}}</ref>


Revision as of 00:18, 27 June 2023

"सीडीएनए" redirects here. For अन्य उपयोग, see सीडीएनए (बहुविकल्पी).
For आणविक जीव विज्ञान में पूरकता की सामान्य गुण, see पूरकता (आणविक जीव विज्ञान). For आनुवंशिकी अनुसंधान में प्रयुक्त पूरक परीक्षण, see पूरकता (आनुवांशिकी).
परीक्षण में प्रयुक्त सीडीएनए डीएनए माइक्रोएरे से आउटपुट

आनुवंशिकी में, पूरक डीएनए (सीडीएनए) एंजाइम विपरीत प्रतिलेखन द्वारा उत्प्रेरित प्रतिक्रिया में एकल सज्जित आरएनए (उदाहरण के लिए, मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) या माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए)) टेम्पलेट से संश्लेषित डीएनए है।[1] सीडीएनए का उपयोग अक्सर कोशिका में एक विशिष्ट प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए किया जाता है जो आम तौर पर उस प्रोटीन को व्यक्त नहीं करता है (यानी, विषम अभिव्यक्ति), या डीएनए-आधारित तरीकों (क्यूपीसीआर, आरएनए-सीक्यू) का उपयोग करके एमआरएनए अणुओं को अनुक्रमित या मात्राबद्ध करने के लिए। सीडीएनए जो एक विशिष्ट प्रोटीन के लिए कोड करता है, उसे अभिव्यक्ति के लिए प्राप्तकर्ता कोशिका में स्थानांतरित किया जा सकता है, अक्सर बैक्टीरिया या यीस्ट अभिव्यक्ति प्रणालियों में। सीडीएनए को माइक्रोएरे, क्यूपीसीआर, और आरएनए-सीक्यू जैसे परीक्षणों में थोक ऊतक, एकल कोशिकाओं या एकल नाभिक में ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए भी तैयार किया जाता है।

सीडीएनए भी स्वाभाविक रूप से रेट्रोवायरस ( जैसे एचआईवी -1, एचआईवी-2, सिमियन प्रतिरक्षण वायरस, आदि (द्वारा निर्मित होता है और फिर मेजबान के जीनोम में एकीकृत होता है, जहां यह एक प्रोवायरस बनाता है।)[2] सीडीएनए शब्द का प्रयोग, आमतौर पर जैव सूचना विज्ञान के संदर्भ में, एमआरएनए प्रतिलेख के अनुक्रम को संदर्भित करने के लिए किया जाता है, जिसे आरएनए बेस (जीसीएयू) के बजाय डीएनए बेस (डीऑक्सी-जीसीएटी) के रूप में व्यक्त किया जाता है।

सीडीएनए की पेटेंट क्षमता एसोसिएशन फॉर मॉलिक्यूलर पैथोलॉजी वी में 2013 के यूएस सुप्रीम कोर्ट के निर्णय का विषय थी। असंख्य आनुवंशिकी, इंक,. एक अनुबंध के रूप में, अदालत ने घोषणा की, कि एक्सॉन-ओनली सीडीएनए पेटेंट-योग्य है, जबकि स्वाभाविक रूप से होने वाले डीएनए के अलग-अलग अनुक्रमों में आंतरिक नहीं हैं।

संश्लेषण

आरएनए सीडीएनए संश्लेषण के लिए एक प्रारूप के रूप में कार्य करता है।[3] कोशिकीय जीवन में, सीडीएनए वायरस और रेट्रोट्रांसपोन्स द्वारा आरएनए के एकीकरण के लिए लक्ष्य जीनोमिक डीएनए में उत्पन्न होता है। आणविक जीव विज्ञान में, जीनोमिक डीएनए, प्रोटीन और अन्य कोशिकीय घटकों को हटाने के बाद स्रोत सामग्री से आरएनए को शुद्ध किया जाता है। फिर सीडीएनए को इन विट्रो विपरीत प्रतिलेखन के माध्यम से संश्लेषित किया जाता है।[4]

आरएनए शुद्धि

आरएनए को होस्ट कोशिकाओं में जीनोमिक डीएनए से लिया जाता है और पहले लिसिंग कोशिकाओं द्वारा निकाला जाता है, फिर फेनोल-क्लोरोफॉर्म, सिलिका कॉलम और बीएड-आधारित आरएनए निष्कर्षण तरीकों जैसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीकों का उपयोग करके आरएनए को शुद्ध किया जाता है।[5] निष्कर्षण विधि स्रोत सामग्री के आधार पर भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, पौधे के ऊतकों से आरएनए को निकालने के लिए अतिरिक्त अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, जैसे पॉलीविनाइलपिरॉलिडोन (पीवीपी), फेनोलिक यौगिकों, कार्बोहाइड्रेट और अन्य यौगिकों को हटाने के लिए जो अन्यथा आरएनए को असामान्य बना देंगे।[6] डीएनए और प्रोटीन को हटाने के लिए, डीनेज और प्रोटीनस के रूप में एंजाइम का उपयोग क्षरण के लिए किया जाता है।[7] महत्वपूर्ण विषय है, आरएनए अखंडता को कैनोट्रोपिक प्रतिरूपकों जैसे कि गुएनिडियम आइसोथियोसाइनेट, सोडियम डोडसाइल सल्फेट (एसडीएस), फेनोल या क्लोरोफॉर्म के साथ निष्क्रिय करके बनाए रखा जाता है। इसके बाद कुल आरएनए को अन्य सेलुलर घटकों से अलग कर दिया जाता है और शराब के साथ उत्पन्न किया जाता है। विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए सरल और त्वरित आरएनए निष्कर्षण के लिए विभिन्न वाणिज्यिक किट मौजूद हैं।[8] अतिरिक्त बीएड-आधारित तरीकों का उपयोग आरएनए के विशिष्ट उप-प्रकार को अलग करने के लिए किया जा सकता है... (जैसे कि एमआरएनए और माइक्रोआरएनए आकार या अद्वितीय आरएनए क्षेत्रों पर आधारित है।[9][10]

विपरीत प्रतिलेखन

प्रथम-चरण संश्लेषण

विपरीत प्रतिलेखन एंजाइम और शुद्ध आरएनए टेम्प्लेट का उपयोग करके, सीडीएनए का एक स्ट्रैंड उत्पन्न किया जाता है (प्रथम-स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण)। मोलोनी मुराइन ल्यूकेमिया वायरस से एम-एमएलवी विपरीत प्रतिलेखन का उपयोग आमतौर पर इसकी कम आरएनएएस एच गतिविधि के कारण किया जाता है जो लंबे आरएनए के ट्रांसक्रिप्शन के लिए अनुकूल है।[11] एवियन मायलोब्लास्टोसिस वायरस से प्राप्त एएमवी विपरीत प्रतिलेखन का उपयोग मजबूत माध्यमिक संरचनाओं (यानी उच्च पिघलने वाले तापमान) वाले आरएनए टेम्पलेट्स के लिए भी किया जा सकता है।[12] सीडीएनए आमतौर पर आरटी-क्यूपीसीआर और आरएनए-सीक्यू जैसे जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एमआरएनए से उत्पन्न होता है।[13] एमआरएनए को ऑलिगो-डीटी प्राइमरों का उपयोग करके चुनिंदा रूप से रिवर्स ट्रांसक्राइब किया जाता है, जो सभी एमआरएनए के 3' सिरे पर पॉली-एडिनाइलेटेड टेल के रिवर्स पूरक हैं। ऑलिगो-डीटी और रैंडम हेक्सामर प्राइमरों का एक अनुकूलित मिश्रण 5' या 3' पूर्वाग्रह को कम करते हुए पूर्ण-लंबाई सीडीएनए प्राप्त करने की संभावना बढ़ाता है।[14] राइबोसोमल आरएनए भी एमआरएनए और गैर-पॉली-एडिनाइलेटेड ट्रांस्क्रिप्ट जैसे कुछ गैर-कोडिंग आरएनए को समृद्ध करने के लिए समाप्त हो सकता है।[15]

द्वितीय-किनारा संश्लेषण

प्रथम-स्ट्रैंड सिंथेसिस, आरएनए-डीएनए हाइब्रिड का परिणाम, कई सेकंड-स्ट्रैंड सिंथेसिस विधियों के माध्यम से संसाधित किया जा सकता है या सीधे डाउनस्ट्रीम एसेज़ में संसाधित किया जा सकता है।[16][17] हेयरपिन-प्राइमेड सिंथेसिस के रूप में जानी जाने वाली एक प्रारंभिक विधि प्रथम-स्ट्रैंड सीडीएनए के 3' छोर पर प्राइम सेकेंड-स्ट्रैंड सिंथेसिस पर हेयरपिन के गठन पर निर्भर करती है। हालाँकि, भड़काना यादृच्छिक है और हेयरपिन हाइड्रोलिसिस से जानकारी का नुकसान होता है। Gubler और हॉफमैन प्रक्रिया E. Coli RNase H का उपयोग mRNA को निकने के लिए करती है जिसे E. Coli DNA पोलीमरेज़ I I से बदल दिया जाता है और E. Coli DNA ligase के साथ सील कर दिया जाता है। इस प्रक्रिया का एक अनुकूलन M-MLV की निम्न RNase H गतिविधि पर निर्भर करता है ताकि शेष RNA के साथ निक mRNA को बाद में दूसरी-स्ट्रैंड cDNA के डीएनए पोलीमरेज़ अनुवाद के बाद RNase H जोड़कर हटा दिया जाए। यह mRNA के 5' छोर पर खोई हुई अनुक्रम सूचना को रोकता है।

अनुप्रयोग

पूरक डीएनए का उपयोग अक्सर क्लोन (आनुवांशिकी) या जीन जांच के रूप में या सीडीएनए पुस्तकालय के निर्माण में किया जाता है। जब वैज्ञानिक प्राप्तकर्ता सेल में प्रोटीन के रूप में नई आनुवंशिक सामग्री को व्यक्त करने के लिए एक जीन को एक सेल से दूसरे सेल में स्थानांतरित करते हैं, तो सीडीएनए को प्राप्तकर्ता (संपूर्ण जीन के बजाय) में जोड़ा जाएगा, क्योंकि पूरे जीन के लिए डीएनए डीएनए शामिल हो सकता है जो प्रोटीन के लिए कोड नहीं करता है या जो प्रोटीन के कोडिंग अनुक्रम को बाधित करता है (जैसे, इंट्रॉन)। सीडीएनए के आंशिक अनुक्रम अक्सर अभिव्यक्त अनुक्रम टैग के रूप में प्राप्त किए जाते हैं।

पोलीमरेज श्रृंखला अभिक्रिया (पीसीआर) के माध्यम से डीएनए अनुक्रमों के प्रवर्धन के साथ, अब आम तौर पर प्रारंभिक चरण के रूप में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन का संचालन किया जाएगा, इसके बाद पीसीआर द्वारा इंट्रा-सेलुलर अभिव्यक्ति के लिए सीडीएनए का सटीक अनुक्रम प्राप्त किया जाएगा। यह अनुक्रम-विशिष्ट डीएनए प्राइमरों को डिज़ाइन करके प्राप्त किया जाता है जो प्रोटीन के लिए कोडिंग सीडीएनए क्षेत्र के 5' और 3' सिरों को संकरणित करता है। एक बार प्रवर्धित करने के बाद, अनुक्रम प्रत्येक छोर पर न्यूक्लियस के साथ काटा जा सकता है और अभिव्यक्ति वैक्टर के रूप में जाने वाले कई छोटे परिपत्र डीएनए अनुक्रमों में से एक में डाला जा सकता है। इस तरह के वैक्टर कोशिकाओं के अंदर स्व-प्रतिकृति और मेजबान डीएनए में संभावित एकीकरण की अनुमति देते हैं। वे आम तौर पर लक्ष्य सीडीएनए के ट्रांसक्रिप्शन को एमआरएनए में चलाने के लिए एक मजबूत प्रमोटर भी रखते हैं, जिसे बाद में प्रोटीन में अनुवादित किया जाता है।

cDNA का उपयोग RNA-seq या रीयल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन | RT-qPCR जैसी विधियों के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए भी किया जाता है।[18][19][20] अनुक्रमण के लिए, अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म आकार सीमाओं के कारण RNA को खंडित किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, सेकेंड-स्ट्रैंड सिंथेसाइज्ड सीडीएनए को एडेप्टर के साथ जोड़ा जाना चाहिए जो सीडीएनए के टुकड़ों को पीसीआर प्रवर्धित करने की अनुमति देता है और सीक्वेंसिंग फ्लो सेल से जुड़ता है। जीन-विशिष्ट विश्लेषण विधियां आमतौर पर फ्लोरोमेट्रिक और अन्य विधियों के माध्यम से सीडीएनए स्तरों की मात्रा निर्धारित करने के लिए माइक्रोएरे और आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग करती हैं।

13 जून 2013 को, संयुक्त राज्य अमेरिका के सुप्रीम कोर्ट ने एसोसिएशन फॉर मॉलिक्यूलर पैथोलॉजी बनाम असंख्य जेनेटिक्स के मामले में फैसला सुनाया कि जबकि स्वाभाविक रूप से होने वाले जीन का पेटेंट नहीं कराया जा सकता है, सीडीएनए पेटेंट-योग्य है क्योंकि यह स्वाभाविक रूप से नहीं होता है।[21]


वायरस और रेट्रोट्रांसपोसन्स

कुछ वायरस अपने वायरल आरएनए को एमआरएनए (वायरल आरएनए → सीडीएनए → एमआरएनए) में बदलने के लिए सीडीएनए का भी उपयोग करते हैं। वायरल प्रोटीन को होस्ट सेल पर कब्जा करने के लिए एमआरएनए का उपयोग किया जाता है।

वायरल आरएनए से सीडीएनए तक के इस पहले चरण का एक उदाहरण संक्रमण के एचआईवी चक्र में देखा जा सकता है। यहां, मेजबान कोशिका झिल्ली वायरस के लिपिड लिफाफे से जुड़ी होती है जो वायरल कैप्सिड को वायरल जीनोम आरएनए की दो प्रतियों के साथ मेजबान में प्रवेश करने की अनुमति देती है। फिर सीडीएनए की प्रतिलिपि वायरल आरएनए के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के माध्यम से बनाई जाती है, एक प्रक्रिया जिसे चैपरोन एसवाईपीए और एक वायरल कैप्सिड संबंधित विपरीत प्रतिलेखन द्वारा सुगम बनाया जाता है।[22] सीडीएनए यूकेरियोटिक जीनोम में रेट्रोट्रांसपोसन द्वारा भी उत्पन्न होता है। रेट्रोट्रांस्पॉन्स मोबाइल जेनेटिक तत्व हैं जो खुद को आरएनए इंटरमीडिएट के माध्यम से जीनोम के भीतर और कभी-कभी बीच में ले जाते हैं। यह तंत्र संक्रामक कणों की उत्पत्ति के बहिष्करण के साथ वायरस के साथ साझा किया जाता है।[23][24]


यह भी देखें

संदर्भ

Mark D. Adams et al. “Complementary DNA Sequencing: Expressed Sequence Tags and Human Genome Project.” Science (American Association for the Advancement of Science) 252.5013 (1991): 1651–1656. Web.

Philip M. Murphy, and H. Lee Tiffany. “Cloning of Complementary DNA Encoding a Functional Human Interleukin-8 Receptor.” Science (American Association for the Advancement of Science) 253.5025 (1991): 1280–1283. Web.

  1. ↑ Hastings, P. J. (1 January 2001), "Complementary DNA (cDNA)", in Brenner, Sydney; Miller, Jefferey H. (eds.), Encyclopedia of Genetics (in English), New York: Academic Press, p. 433, ISBN 978-0-12-227080-2, retrieved 29 November 2022
  2. ↑ Croy, Ron. "आणविक आनुवंशिकी II - जेनेटिक इंजीनियरिंग कोर्स (अनुपूरक नोट)". Durham University durham.ac.uk; 20 April 1998. Archived from the original on 24 August 2002. Retrieved 4 February 2015.
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  5. ↑ Tavares, Lucélia; Alves, Paula M.; Ferreira, Ricardo B.; Santos, Claudia N. (6 January 2011). "एसके-एन-एमसी न्यूरोब्लास्टोमा से डीएनए मुक्त आरएनए अलगाव के लिए विभिन्न तरीकों की तुलना". BMC Research Notes. 4 (1): 3. doi:10.1186/1756-0500-4-3. ISSN 1756-0500. PMC 3050700. PMID 21211020.
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  24. ↑ Cordaux, Richard; Batzer, Mark A. (October 2009). "मानव जीनोम के विकास पर रेट्रोट्रांस्पोन्स का प्रभाव". Nature Reviews Genetics (in English). 10 (10): 691–703. doi:10.1038/nrg2640. ISSN 1471-0064. PMC 2884099. PMID 19763152.


बाहरी संबंध

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