उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग: Difference between revisions
No edit summary |
No edit summary |
||
| Line 1: | Line 1: | ||
'''उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग''' (एचसीएस), जिसे उच्च-सामग्री विश्लेषण (एचसीए) या [[सेलोमिक्स]] के रूप में भी जाना जाता है, ऐसी विधि है जिसका उपयोग जैविक अनुसंधान और | '''उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग''' (एचसीएस), जिसे उच्च-सामग्री विश्लेषण (एचसीए) या [[सेलोमिक्स]] के रूप में भी जाना जाता है, ऐसी विधि है जिसका उपयोग जैविक अनुसंधान और औषधि शोध में अल्प अणुओं, [[पेप्टाइड|पेप्टाइड्स]] या [[आरएनएआई]] जैसे पदार्थों की पहचान करने के लिए किया जाता है जो [[फेनोटाइप]] को परिवर्तित करते हैं। वांछित प्रविधि से कोशिका (जीवविज्ञान)।<ref name="Haney_2008">{{cite book | editor = Haney SA | title = उच्च सामग्री स्क्रीनिंग: विज्ञान, तकनीक और अनुप्रयोग| publisher = Wiley-Interscience | location = New York | year = 2008 | isbn = 978-0-470-03999-1 }}</ref><ref name="Giuliano_Haskins_2010">{{cite book | editor = Giuliano KA, Haskins JR | title = उच्च सामग्री स्क्रीनिंग: सिस्टम सेल बायोलॉजी और ड्रग डिस्कवरी के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण| publisher = Humana Press | location = Totowa, NJ | year = 2010 | isbn = 978-1-61737-746-4 }}</ref> इसलिए उच्च सामग्री स्क्रीनिंग प्रकार की [[फेनोटाइपिक स्क्रीन]] है जो कोशिकाओं में आयोजित की जाती है जिसमें कई पैरामीटरों के साथ रीडआउट के साथ संपूर्ण कोशिकाओं या कोशिकाओं के घटकों का विश्लेषण सम्मिलित होता है।<ref name="Gasparri_2009">{{cite journal | vauthors = Gasparri F | title = एचसीएस में सेल फेनोटाइप का अवलोकन: सीमाएं और फायदे| journal = Expert Opinion on Drug Discovery | volume = 4 | issue = 6 | pages = 643–657 | date = June 2009 | doi = 10.1517/17460440902992870 | pmid = 23489157 | s2cid = 10771109 }}</ref> एचसीएस [[उच्च परिणाम स्क्रीनिंग]] (एचटीएस) से संबंधित है, जिसमें या अधिक जैविक परख में उनकी गतिविधि के लिए हजारों यौगिकों का समानांतर में परीक्षण किया जाता है, किन्तु आउटपुट के रूप में अधिक जटिल सेलुलर फेनोटाइप की परख सम्मिलित होती है। फेनोटाइपिक परिवर्तनों में [[प्रोटीन]] जैसे सेलुलर उत्पादों के उत्पादन में वृद्धि या कमी या कोशिका की आकृति विज्ञान (जीव विज्ञान) (दृश्य उपस्थिति) में परिवर्तन सम्मिलित हो सकते हैं। इसलिए एचसीए में सामान्यतः स्वचालित माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण सम्मिलित होता है।<ref name="Varma2011"/>उच्च-सामग्री विश्लेषण के विपरीत, उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग का तात्पर्य थ्रूपुट के स्तर से है, यही कारण है कि स्क्रीनिंग शब्द एचसीएस को एचसीए से भिन्न करता है, जो सामग्री में उच्च किन्तु थ्रूपुट में अर्घ्य हो सकता है। | ||
उच्च सामग्री स्क्रीनिंग में, कोशिकाओं को | उच्च सामग्री स्क्रीनिंग में, कोशिकाओं को पदार्थ के साथ ऊष्मायन अवधि में रखा जाता है और समय की अवधि के पश्चात, कोशिकाओं की संरचनाओं और आणविक घटकों का विश्लेषण किया जाता है। सबसे सरल विश्लेषण में [[फ्लोरोसेंट टैग]] के साथ प्रोटीन को लेबल करना सम्मिलित है, और अंत में स्वचालित [[छवि विश्लेषण]] का उपयोग करके सेल फेनोटाइप में परिवर्तन को मापा जाता है। विभिन्न अवशोषण और उत्सर्जन मैक्सिमा के साथ फ्लोरोसेंट टैग के उपयोग के माध्यम से, समानांतर में कई भिन्न-भिन्न सेल घटकों को मापना संभव है। इसके अतिरिक्त, इमेजिंग उपकोशिकीय स्तर पर परिवर्तनों की जानकारी प्राप्त करने में सक्षम है (उदाहरण के लिए, [[ कोशिका द्रव्य ]]के प्रति [[ कोशिका केंद्रक |कोशिका केंद्रक]] के प्रति अन्य [[अंगक]])। इसलिए, प्रति सेल बड़ी संख्या में डेटा पॉइंट एकत्र किए जा सकते हैं। फ्लोरोसेंट लेबलिंग के अतिरिक्त, उच्च सामग्री स्क्रीनिंग में विभिन्न लेबल मुक्त परख का उपयोग किया गया है।<ref name="pmid17612548">{{cite journal | vauthors = Proll G, Steinle L, Pröll F, Kumpf M, Moehrle B, Mehlmann M, Gauglitz G | title = उच्च-सामग्री-स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों में लेबल-मुक्त पहचान की क्षमता| journal = J Chromatogr A | volume = 1161 | issue = 1–2 | pages = 2–8 | date = August 2007 | pmid = 17612548 | doi = 10.1016/j.chroma.2007.06.022 }}</ref> | ||
== सामान्य सिद्धांत == | == सामान्य सिद्धांत == | ||
[[File:Pills on uv box.jpg|thumb|एचसीएस के अनुप्रयोगों में से नई | [[File:Pills on uv box.jpg|thumb|एचसीएस के अनुप्रयोगों में से नई औषधि उम्मीऔषधिरों की शोध है]]कोशिका-आधारित प्रणालियों में उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग (एचसीएस) सामान्य और रोगग्रस्त कोशिकाओं के कामकाज को स्पष्ट करने के लिए जैविक अनुसंधान में उपकरण के रूप में जीवित कोशिका (जीव विज्ञान) का उपयोग करती है। एचसीएस का उपयोग नई औषधि उम्मीऔषधिरों की शोध और अनुकूलन के लिए भी किया जाता है। उच्च सामग्री स्क्रीनिंग आधुनिक कोशिका जीव विज्ञान का संयोजन है, जिसमें इसके सभी आणविक उपकरण, स्वचालित उच्च रिज़ॉल्यूशन [[माइक्रोस्कोपी]] और रोबोटिक हैंडलिंग सम्मिलित हैं। कोशिकाएं सबसे पहले रसायनों या आरएनएआई अभिकर्मकों के संपर्क में आती हैं। फिर छवि विश्लेषण का उपयोग करके कोशिका आकृति विज्ञान में परिवर्तन का पता लगाया जाता है। कोशिकाओं द्वारा संश्लेषित प्रोटीन की मात्रा में परिवर्तन को विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके मापा जाता है जैसे कि [[हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन]] अंतर्जात प्रोटीन से जुड़े होते हैं, या [[इम्यूनोफ्लोरेसेंस]] द्वारा। | ||
प्रौद्योगिकी का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि कोई संभावित | प्रौद्योगिकी का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि कोई संभावित औषधि रोग को संशोधित करने वाली है या नहीं। उदाहरण के लिए, मनुष्यों में [[जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर]]्स (जीपीसीआर) लगभग 880 कोशिका सतह प्रोटीन का बड़ा परिवार है जो पर्यावरण में कोशिका प्रतिक्रिया में अतिरिक्त-सेलुलर परिवर्तनों को स्थानांतरित करता है, जैसे कि रिलीज के कारण रक्तचाप में वृद्धि को ट्रिगर करना। रक्त प्रवाह में नियामक हार्मोन. इन जीपीसीआर के सक्रियण में कोशिकाओं में उनका प्रवेश सम्मिलित हो सकता है और जब इसकी कल्पना की जा सकती है तो यह [[रसायनविज्ञान]], व्यवस्थित [[जीनोम]] वाइड स्क्रीनिंग या शारीरिक हेरफेर के माध्यम से रिसेप्टर फ़ंक्शन के व्यवस्थित विश्लेषण का आधार हो सकता है। | ||
सेलुलर स्तर पर, विभिन्न सेल गुणों पर डेटा का समानांतर अधिग्रहण, उदाहरण के लिए [[ संकेत पारगमन ]] कैस्केड और [[ cytoskeleton ]] अखंडता की गतिविधि, तेज | सेलुलर स्तर पर, विभिन्न सेल गुणों पर डेटा का समानांतर अधिग्रहण, उदाहरण के लिए [[ संकेत पारगमन ]] कैस्केड और [[ cytoskeleton ]] अखंडता की गतिविधि, तेज किन्तु कम विस्तृत [[उच्च परिणाम स्क्रीनिंग]] की तुलना में इस पद्धति का मुख्य लाभ है। जबकि एचसीएस धीमा है, अधिग्रहीत डेटा की प्रचुरता औषधि के प्रभावों की अधिक गहन समझ की अनुमति देती है। | ||
स्वचालित छवि आधारित स्क्रीनिंग सेलुलर [[समलक्षणियों]] को बदलने वाले | स्वचालित छवि आधारित स्क्रीनिंग सेलुलर [[समलक्षणियों]] को बदलने वाले अल्प यौगिकों की पहचान की अनुमति देती है और सेल फ़ंक्शन को संशोधित करने के लिए नई [[ दवाइयों | औषधिइयों]] और नए सेल जैविक उपकरणों की शोध के लिए रुचि रखती है। सेलुलर फेनोटाइप के आधार पर अणुओं के चयन के लिए यौगिकों से प्रभावित होने वाले जैव रासायनिक लक्ष्यों के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता नहीं होती है। हालाँकि [[जैविक लक्ष्य]] की पहचान पश्चात के प्रीक्लिनिकल अनुकूलन और यौगिक हिट के नैदानिक विकास को काफी आसान बना देगी। कोशिका जैविक उपकरण के रूप में फेनोटाइपिक/दृश्य स्क्रीनिंग के उपयोग में वृद्धि को देखते हुए, ऐसे तरीकों की आवश्यकता होती है जो व्यवस्थित जैव रासायनिक लक्ष्य पहचान की अनुमति देते हैं यदि इन अणुओं का व्यापक उपयोग हो।<ref>{{cite journal | vauthors = Burdine L, Kodadek T | title = Target identification in chemical genetics: The (often) missing link | journal = Chem. Biol. | volume = 11 | issue = 5 | pages = 593–7 | date = May 2004 | pmid = 15157870 | doi = 10.1016/j.chembiol.2004.05.001 | doi-access = free }}</ref> लक्ष्य पहचान को रासायनिक आनुवंशिकी/उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग में दर सीमित करने वाले कदम के रूप में परिभाषित किया गया है।<ref name="Eggert_Mitchison_2006">{{cite journal | vauthors = Eggert US, Mitchison TJ | title = इमेजिंग द्वारा छोटे अणु की स्क्रीनिंग| journal = Curr Opin Chem Biol | volume = 10 | issue = 3 | pages = 232–7 | date = June 2006 | pmid = 16682248 | doi = 10.1016/j.cbpa.2006.04.010 }}</ref> | ||
== इंस्ट्रुमेंटेशन == | == इंस्ट्रुमेंटेशन == | ||
[[File:Automated confocal image reader.jpg|thumb|स्वचालित कन्फोकल छवि रीडर]]उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग तकनीक मुख्य रूप से डेटा के विश्लेषण और भंडारण के लिए आईटी-सिस्टम के संयोजन में स्वचालित डिजिटल [[माइक्रोस्कोप]]ी और [[ फ़्लो साइटॉमेट्री ]] पर आधारित है। | [[File:Automated confocal image reader.jpg|thumb|स्वचालित कन्फोकल छवि रीडर]]उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग तकनीक मुख्य रूप से डेटा के विश्लेषण और भंडारण के लिए आईटी-सिस्टम के संयोजन में स्वचालित डिजिटल [[माइक्रोस्कोप]]ी और [[ फ़्लो साइटॉमेट्री ]] पर आधारित है। | ||
"उच्च-सामग्री" या दृश्य जीवविज्ञान प्रौद्योगिकी के दो उद्देश्य हैं, पहला किसी घटना पर स्थानिक या अस्थायी रूप से हल की गई जानकारी प्राप्त करना और दूसरा स्वचालित रूप से इसकी मात्रा निर्धारित करना। स्थानिक रूप से हल किए गए उपकरण | "उच्च-सामग्री" या दृश्य जीवविज्ञान प्रौद्योगिकी के दो उद्देश्य हैं, पहला किसी घटना पर स्थानिक या अस्थायी रूप से हल की गई जानकारी प्राप्त करना और दूसरा स्वचालित रूप से इसकी मात्रा निर्धारित करना। स्थानिक रूप से हल किए गए उपकरण सामान्यतःस्वचालित सूक्ष्मदर्शी होते हैं, और अस्थायी समाधान के लिए अभी भी ज्यादातर मामलों में कुछ प्रकार के प्रतिदीप्ति माप की आवश्यकता होती है। इसका मतलब यह है कि बहुत सारे एचसीएस उपकरण (प्रतिदीप्ति) माइक्रोस्कोप हैं जो किसी न किसी रूप में छवि विश्लेषण पैकेज से जुड़े होते हैं। ये कोशिकाओं की [[रोशनी]] छवियां लेने के सभी चरणों का ध्यान रखते हैं और प्रयोगों का त्वरित, स्वचालित और निष्पक्ष मूल्यांकन प्रदान करते हैं। | ||
आज बाजार में एचसीएस उपकरणों को विशिष्टताओं की श्रृंखला के आधार पर | आज बाजार में एचसीएस उपकरणों को विशिष्टताओं की श्रृंखला के आधार पर भिन्न किया जा सकता है जो उपकरणों की बहुमुखी प्रतिभा और समग्र लागत को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करते हैं। इनमें गति, जीवित कोशिका कक्ष जिसमें तापमान और सम्मिलित है {{CO2}} नियंत्रण (कुछ में लंबे समय तक लाइव सेल इमेजिंग के लिए आर्द्रता नियंत्रण भी होता है), तेज गतिज परख के लिए अंतर्निहित पिपेटर या इंजेक्टर, और अतिरिक्त इमेजिंग मोड जैसे [[ कोंफोकल ]], उज्ज्वल क्षेत्र, चरण कंट्रास्ट और एफआरईटी। सबसे गंभीर अंतरों में से यह है कि उपकरण ऑप्टिकल कन्फोकल हैं या नहीं। [[ संनाभि माइक्रोस्कोपी ]] का सारांश किसी वस्तु के माध्यम से पतली स्लाइस की इमेजिंग/समाधान करना और इस स्लाइस के बाहर से आने वाले फोकस प्रकाश को अस्वीकार करना है। कन्फ़ोकल इमेजिंग अधिक सामान्य रूप से लागू [[प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी]] की तुलना में शोर और उच्च रिज़ॉल्यूशन के लिए उच्च छवि संकेत सक्षम करती है। उपकरण के आधार पर कन्फोकैलिटी लेजर स्कैनिंग, पिनहोल या स्लिट के साथ ल कताई डिस्क, दोहरी कताई डिस्क, या वर्चुअल स्लिट के माध्यम से प्राप्त की जाती है। इन विभिन्न कन्फोकल तकनीकों के बीच संवेदनशीलता, रिज़ॉल्यूशन, गति, फोटो-टॉक्सिसिटी, फोटो-ब्लीचिंग, उपकरण जटिलता और कीमत का व्यापार होता है। | ||
सभी उपकरण छवियों को स्वचालित रूप से लेने, संग्रहीत करने और व्याख्या करने और बड़े रोबोटिक सेल/मध्यम हैंडलिंग प्लेटफार्मों में ीकृत करने की क्षमता साझा करते हैं। | सभी उपकरण छवियों को स्वचालित रूप से लेने, संग्रहीत करने और व्याख्या करने और बड़े रोबोटिक सेल/मध्यम हैंडलिंग प्लेटफार्मों में ीकृत करने की क्षमता साझा करते हैं। | ||
| Line 25: | Line 25: | ||
== अनुप्रयोग == | == अनुप्रयोग == | ||
यह तकनीक (बहुत) बड़ी संख्या में प्रयोग करने की अनुमति देती है, जिससे | यह तकनीक (बहुत) बड़ी संख्या में प्रयोग करने की अनुमति देती है, जिससे शोधपूर्ण स्क्रीनिंग की अनुमति मिलती है। सेल-आधारित सिस्टम का उपयोग मुख्य रूप से रासायनिक आनुवंशिकी में किया जाता है जहां बड़े, विविध अल्प अणु संग्रह को सेलुलर मॉडल सिस्टम पर उनके प्रभाव के लिए व्यवस्थित रूप से परीक्षण किया जाता है। हजारों अणुओं की स्क्रीन का उपयोग करके नवीन औषधिएं पाई जा सकती हैं, और इनमें औषधि विकास के भविष्य की संभावनाएं हैं। | ||
औषधि की शोध से परे, रासायनिक आनुवंशिकी का उद्देश्य अल्प अणुओं की पहचान करके जीनोम को क्रियाशील बनाना है जो कोशिका में 21,000 जीन उत्पादों में से अधिकांश पर कार्य करता है। उच्च-सामग्री प्रौद्योगिकी इस प्रयास का हिस्सा होगी जो यह सीखने के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान कर सकती है कि प्रोटीन कहाँ और कब रासायनिक रूप से नष्ट करके कार्य करते हैं। यह जीन के लिए सबसे उपयोगी होगा जहां नॉक आउट चूहों ( या कई जीन गायब) का निर्माण नहीं किया जा सकता है क्योंकि विकास, विकास या अन्यथा घातक होने के लिए प्रोटीन की आवश्यकता होती है। केमिकल नॉक आउट यह पता लगा सकता है कि ये जीन कैसे और कहाँ काम करते हैं। | |||
इसके | इसके अतिरिक्त प्रौद्योगिकी का उपयोग आरएनएआई के साथ संयोजन में विशिष्ट तंत्रों में सम्मिलित जीन के सेट की पहचान करने के लिए किया जाता है, उदाहरण के लिए कोशिका विभाजन। यहां, लक्ष्य जीव के जीनोम के अंदर पूर्वानुमानित जीनों के पूरे सेट को कवर करने वाले आरएनएआई के पुस्तकालयों का उपयोग प्रासंगिक उपसमूहों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जिससे जीन की एनोटेशन की सुविधा मिलती है जिसके लिए पहले से कोई स्पष्ट भूमिका स्थापित नहीं की गई है। | ||
स्वचालित कोशिका जीव विज्ञान द्वारा उत्पादित बड़े डेटासेट में स्थानिक रूप से हल किया गया, मात्रात्मक डेटा होता है जिसका उपयोग सिस्टम स्तर के मॉडल और कोशिकाओं और जीवों के कार्य करने के सिमुलेशन के निर्माण के लिए किया जा सकता है। सेल फ़ंक्शन के सिस्टम बायोलॉजी मॉडल यह भविष्यवाणी करने की अनुमति देंगे कि सेल बाहरी परिवर्तनों, विकास और बीमारी पर क्यों, कहां और कैसे प्रतिक्रिया करता है। | स्वचालित कोशिका जीव विज्ञान द्वारा उत्पादित बड़े डेटासेट में स्थानिक रूप से हल किया गया, मात्रात्मक डेटा होता है जिसका उपयोग सिस्टम स्तर के मॉडल और कोशिकाओं और जीवों के कार्य करने के सिमुलेशन के निर्माण के लिए किया जा सकता है। सेल फ़ंक्शन के सिस्टम बायोलॉजी मॉडल यह भविष्यवाणी करने की अनुमति देंगे कि सेल बाहरी परिवर्तनों, विकास और बीमारी पर क्यों, कहां और कैसे प्रतिक्रिया करता है। | ||
== इतिहास == | == इतिहास == | ||
उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग तकनीक अक्षुण्ण जैविक प्रणालियों में कई जैव रासायनिक और रूपात्मक | उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग तकनीक अक्षुण्ण जैविक प्रणालियों में कई जैव रासायनिक और रूपात्मक पैरामीटरों के मूल्यांकन की अनुमति देती है। | ||
कोशिका-आधारित दृष्टिकोणों के लिए स्वचालित कोशिका जीव विज्ञान की उपयोगिता के लिए इस बात की जांच की आवश्यकता होती है कि स्वचालन और वस्तुनिष्ठ माप कैसे प्रयोग और रोग की समझ को बेहतर बना सकते हैं। सबसे पहले, यह कोशिका जीव विज्ञान अनुसंधान के अधिकांश, | कोशिका-आधारित दृष्टिकोणों के लिए स्वचालित कोशिका जीव विज्ञान की उपयोगिता के लिए इस बात की जांच की आवश्यकता होती है कि स्वचालन और वस्तुनिष्ठ माप कैसे प्रयोग और रोग की समझ को बेहतर बना सकते हैं। सबसे पहले, यह कोशिका जीव विज्ञान अनुसंधान के अधिकांश, किन्तु सभी नहीं, पहलुओं में अन्वेषक के प्रभाव को हटा देता है और दूसरा, यह पूरी तरह से नए दृष्टिकोण को संभव बनाता है। | ||
समीक्षा में, शास्त्रीय 20वीं सदी के कोशिका जीव विज्ञान ने संस्कृति में विकसित कोशिका रेखाओं का उपयोग किया जहां प्रयोगों को यहां वर्णित के समान ही मापा गया था, | समीक्षा में, शास्त्रीय 20वीं सदी के कोशिका जीव विज्ञान ने संस्कृति में विकसित कोशिका रेखाओं का उपयोग किया जहां प्रयोगों को यहां वर्णित के समान ही मापा गया था, किन्तु वहां अन्वेषक ने इस पर चुनाव किया कि क्या मापा जाए और कैसे मापा जाए। 1990 के दशक की शुरुआत में, अनुसंधान के लिए चार्ज-युग्मित डिवाइस कैमरे (चार्ज युग्मित डिवाइस कैमरे) के विकास ने कोशिकाओं के चित्रों में विशेषताओं को मापने का अवसर पैदा किया- जैसे कि नाभिक में कितना प्रोटीन है, कितना बाहर है। जल्द ही नए फ्लोरोसेंट अणुओं का उपयोग करके परिष्कृत माप किए गए, जिनका उपयोग [[दूसरा संदेशवाहक]] सांद्रता या आंतरिक सेल डिब्बों के पीएच जैसे सेल गुणों को मापने के लिए किया जाता है। हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जेलीफ़िश के प्राकृतिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन अणु के व्यापक उपयोग ने कोशिका जीव विज्ञान में मुख्यधारा की तकनीक के रूप में सेल इमेजिंग की ओर रुझान को तेज कर दिया। इन प्रगतियों के बावजूद, किस सेल की छवि बनानी है और कौन सा डेटा प्रस्तुत करना है और इसका विश्लेषण कैसे करना है, इसका चयन अभी भी अन्वेषक द्वारा किया गया था। | ||
सादृश्य से, यदि कोई फुटबॉल मैदान और उसके पार रखी खाने की प्लेटों की कल्पना करता है, तो उन सभी को देखने के बजाय, अन्वेषक स्कोर रेखा के पास मुट्ठी भर प्लेटें चुन लेगा और बाकी को छोड़ना होगा। इस सादृश्य में क्षेत्र टिशू कल्चर डिश है, जिस पर प्लेटें कोशिकाएं बढ़ती हैं। जबकि यह उचित और व्यावहारिक दृष्टिकोण था, पूरी प्रक्रिया का स्वचालन और विश्लेषण जीवित कोशिकाओं की पूरी | सादृश्य से, यदि कोई फुटबॉल मैदान और उसके पार रखी खाने की प्लेटों की कल्पना करता है, तो उन सभी को देखने के बजाय, अन्वेषक स्कोर रेखा के पास मुट्ठी भर प्लेटें चुन लेगा और बाकी को छोड़ना होगा। इस सादृश्य में क्षेत्र टिशू कल्चर डिश है, जिस पर प्लेटें कोशिकाएं बढ़ती हैं। जबकि यह उचित और व्यावहारिक दृष्टिकोण था, पूरी प्रक्रिया का स्वचालन और विश्लेषण जीवित कोशिकाओं की पूरी आपश्चाती का विश्लेषण संभव बनाता है, इसलिए पूरे फुटबॉल मैदान को मापा जा सकता है। | ||
== यह भी देखें == | == यह भी देखें == | ||
* | *औषधिओं की शोध | ||
*उच्च परिणाम स्क्रीनिंग | *उच्च परिणाम स्क्रीनिंग | ||
* [[दवा की खोज ने नेतृत्व को प्रभावित किया]] | * [[दवा की खोज ने नेतृत्व को प्रभावित किया|औषधि की शोध ने नेतृत्व को प्रभावित किया]] | ||
*माइक्रोस्कोपी | *माइक्रोस्कोपी | ||
*फ़्लो साइटॉमेट्री | *फ़्लो साइटॉमेट्री | ||
Revision as of 10:56, 15 July 2023
उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग (एचसीएस), जिसे उच्च-सामग्री विश्लेषण (एचसीए) या सेलोमिक्स के रूप में भी जाना जाता है, ऐसी विधि है जिसका उपयोग जैविक अनुसंधान और औषधि शोध में अल्प अणुओं, पेप्टाइड्स या आरएनएआई जैसे पदार्थों की पहचान करने के लिए किया जाता है जो फेनोटाइप को परिवर्तित करते हैं। वांछित प्रविधि से कोशिका (जीवविज्ञान)।[1][2] इसलिए उच्च सामग्री स्क्रीनिंग प्रकार की फेनोटाइपिक स्क्रीन है जो कोशिकाओं में आयोजित की जाती है जिसमें कई पैरामीटरों के साथ रीडआउट के साथ संपूर्ण कोशिकाओं या कोशिकाओं के घटकों का विश्लेषण सम्मिलित होता है।[3] एचसीएस उच्च परिणाम स्क्रीनिंग (एचटीएस) से संबंधित है, जिसमें या अधिक जैविक परख में उनकी गतिविधि के लिए हजारों यौगिकों का समानांतर में परीक्षण किया जाता है, किन्तु आउटपुट के रूप में अधिक जटिल सेलुलर फेनोटाइप की परख सम्मिलित होती है। फेनोटाइपिक परिवर्तनों में प्रोटीन जैसे सेलुलर उत्पादों के उत्पादन में वृद्धि या कमी या कोशिका की आकृति विज्ञान (जीव विज्ञान) (दृश्य उपस्थिति) में परिवर्तन सम्मिलित हो सकते हैं। इसलिए एचसीए में सामान्यतः स्वचालित माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण सम्मिलित होता है।[4]उच्च-सामग्री विश्लेषण के विपरीत, उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग का तात्पर्य थ्रूपुट के स्तर से है, यही कारण है कि स्क्रीनिंग शब्द एचसीएस को एचसीए से भिन्न करता है, जो सामग्री में उच्च किन्तु थ्रूपुट में अर्घ्य हो सकता है।
उच्च सामग्री स्क्रीनिंग में, कोशिकाओं को पदार्थ के साथ ऊष्मायन अवधि में रखा जाता है और समय की अवधि के पश्चात, कोशिकाओं की संरचनाओं और आणविक घटकों का विश्लेषण किया जाता है। सबसे सरल विश्लेषण में फ्लोरोसेंट टैग के साथ प्रोटीन को लेबल करना सम्मिलित है, और अंत में स्वचालित छवि विश्लेषण का उपयोग करके सेल फेनोटाइप में परिवर्तन को मापा जाता है। विभिन्न अवशोषण और उत्सर्जन मैक्सिमा के साथ फ्लोरोसेंट टैग के उपयोग के माध्यम से, समानांतर में कई भिन्न-भिन्न सेल घटकों को मापना संभव है। इसके अतिरिक्त, इमेजिंग उपकोशिकीय स्तर पर परिवर्तनों की जानकारी प्राप्त करने में सक्षम है (उदाहरण के लिए, कोशिका द्रव्य के प्रति कोशिका केंद्रक के प्रति अन्य अंगक)। इसलिए, प्रति सेल बड़ी संख्या में डेटा पॉइंट एकत्र किए जा सकते हैं। फ्लोरोसेंट लेबलिंग के अतिरिक्त, उच्च सामग्री स्क्रीनिंग में विभिन्न लेबल मुक्त परख का उपयोग किया गया है।[5]
सामान्य सिद्धांत
कोशिका-आधारित प्रणालियों में उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग (एचसीएस) सामान्य और रोगग्रस्त कोशिकाओं के कामकाज को स्पष्ट करने के लिए जैविक अनुसंधान में उपकरण के रूप में जीवित कोशिका (जीव विज्ञान) का उपयोग करती है। एचसीएस का उपयोग नई औषधि उम्मीऔषधिरों की शोध और अनुकूलन के लिए भी किया जाता है। उच्च सामग्री स्क्रीनिंग आधुनिक कोशिका जीव विज्ञान का संयोजन है, जिसमें इसके सभी आणविक उपकरण, स्वचालित उच्च रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी और रोबोटिक हैंडलिंग सम्मिलित हैं। कोशिकाएं सबसे पहले रसायनों या आरएनएआई अभिकर्मकों के संपर्क में आती हैं। फिर छवि विश्लेषण का उपयोग करके कोशिका आकृति विज्ञान में परिवर्तन का पता लगाया जाता है। कोशिकाओं द्वारा संश्लेषित प्रोटीन की मात्रा में परिवर्तन को विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके मापा जाता है जैसे कि हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन अंतर्जात प्रोटीन से जुड़े होते हैं, या इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा।
प्रौद्योगिकी का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि कोई संभावित औषधि रोग को संशोधित करने वाली है या नहीं। उदाहरण के लिए, मनुष्यों में जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) लगभग 880 कोशिका सतह प्रोटीन का बड़ा परिवार है जो पर्यावरण में कोशिका प्रतिक्रिया में अतिरिक्त-सेलुलर परिवर्तनों को स्थानांतरित करता है, जैसे कि रिलीज के कारण रक्तचाप में वृद्धि को ट्रिगर करना। रक्त प्रवाह में नियामक हार्मोन. इन जीपीसीआर के सक्रियण में कोशिकाओं में उनका प्रवेश सम्मिलित हो सकता है और जब इसकी कल्पना की जा सकती है तो यह रसायनविज्ञान, व्यवस्थित जीनोम वाइड स्क्रीनिंग या शारीरिक हेरफेर के माध्यम से रिसेप्टर फ़ंक्शन के व्यवस्थित विश्लेषण का आधार हो सकता है।
सेलुलर स्तर पर, विभिन्न सेल गुणों पर डेटा का समानांतर अधिग्रहण, उदाहरण के लिए संकेत पारगमन कैस्केड और cytoskeleton अखंडता की गतिविधि, तेज किन्तु कम विस्तृत उच्च परिणाम स्क्रीनिंग की तुलना में इस पद्धति का मुख्य लाभ है। जबकि एचसीएस धीमा है, अधिग्रहीत डेटा की प्रचुरता औषधि के प्रभावों की अधिक गहन समझ की अनुमति देती है।
स्वचालित छवि आधारित स्क्रीनिंग सेलुलर समलक्षणियों को बदलने वाले अल्प यौगिकों की पहचान की अनुमति देती है और सेल फ़ंक्शन को संशोधित करने के लिए नई औषधिइयों और नए सेल जैविक उपकरणों की शोध के लिए रुचि रखती है। सेलुलर फेनोटाइप के आधार पर अणुओं के चयन के लिए यौगिकों से प्रभावित होने वाले जैव रासायनिक लक्ष्यों के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता नहीं होती है। हालाँकि जैविक लक्ष्य की पहचान पश्चात के प्रीक्लिनिकल अनुकूलन और यौगिक हिट के नैदानिक विकास को काफी आसान बना देगी। कोशिका जैविक उपकरण के रूप में फेनोटाइपिक/दृश्य स्क्रीनिंग के उपयोग में वृद्धि को देखते हुए, ऐसे तरीकों की आवश्यकता होती है जो व्यवस्थित जैव रासायनिक लक्ष्य पहचान की अनुमति देते हैं यदि इन अणुओं का व्यापक उपयोग हो।[6] लक्ष्य पहचान को रासायनिक आनुवंशिकी/उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग में दर सीमित करने वाले कदम के रूप में परिभाषित किया गया है।[7]
इंस्ट्रुमेंटेशन
उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग तकनीक मुख्य रूप से डेटा के विश्लेषण और भंडारण के लिए आईटी-सिस्टम के संयोजन में स्वचालित डिजिटल माइक्रोस्कोपी और फ़्लो साइटॉमेट्री पर आधारित है।
"उच्च-सामग्री" या दृश्य जीवविज्ञान प्रौद्योगिकी के दो उद्देश्य हैं, पहला किसी घटना पर स्थानिक या अस्थायी रूप से हल की गई जानकारी प्राप्त करना और दूसरा स्वचालित रूप से इसकी मात्रा निर्धारित करना। स्थानिक रूप से हल किए गए उपकरण सामान्यतःस्वचालित सूक्ष्मदर्शी होते हैं, और अस्थायी समाधान के लिए अभी भी ज्यादातर मामलों में कुछ प्रकार के प्रतिदीप्ति माप की आवश्यकता होती है। इसका मतलब यह है कि बहुत सारे एचसीएस उपकरण (प्रतिदीप्ति) माइक्रोस्कोप हैं जो किसी न किसी रूप में छवि विश्लेषण पैकेज से जुड़े होते हैं। ये कोशिकाओं की रोशनी छवियां लेने के सभी चरणों का ध्यान रखते हैं और प्रयोगों का त्वरित, स्वचालित और निष्पक्ष मूल्यांकन प्रदान करते हैं।
आज बाजार में एचसीएस उपकरणों को विशिष्टताओं की श्रृंखला के आधार पर भिन्न किया जा सकता है जो उपकरणों की बहुमुखी प्रतिभा और समग्र लागत को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करते हैं। इनमें गति, जीवित कोशिका कक्ष जिसमें तापमान और सम्मिलित है CO2 नियंत्रण (कुछ में लंबे समय तक लाइव सेल इमेजिंग के लिए आर्द्रता नियंत्रण भी होता है), तेज गतिज परख के लिए अंतर्निहित पिपेटर या इंजेक्टर, और अतिरिक्त इमेजिंग मोड जैसे कोंफोकल , उज्ज्वल क्षेत्र, चरण कंट्रास्ट और एफआरईटी। सबसे गंभीर अंतरों में से यह है कि उपकरण ऑप्टिकल कन्फोकल हैं या नहीं। संनाभि माइक्रोस्कोपी का सारांश किसी वस्तु के माध्यम से पतली स्लाइस की इमेजिंग/समाधान करना और इस स्लाइस के बाहर से आने वाले फोकस प्रकाश को अस्वीकार करना है। कन्फ़ोकल इमेजिंग अधिक सामान्य रूप से लागू प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की तुलना में शोर और उच्च रिज़ॉल्यूशन के लिए उच्च छवि संकेत सक्षम करती है। उपकरण के आधार पर कन्फोकैलिटी लेजर स्कैनिंग, पिनहोल या स्लिट के साथ ल कताई डिस्क, दोहरी कताई डिस्क, या वर्चुअल स्लिट के माध्यम से प्राप्त की जाती है। इन विभिन्न कन्फोकल तकनीकों के बीच संवेदनशीलता, रिज़ॉल्यूशन, गति, फोटो-टॉक्सिसिटी, फोटो-ब्लीचिंग, उपकरण जटिलता और कीमत का व्यापार होता है।
सभी उपकरण छवियों को स्वचालित रूप से लेने, संग्रहीत करने और व्याख्या करने और बड़े रोबोटिक सेल/मध्यम हैंडलिंग प्लेटफार्मों में ीकृत करने की क्षमता साझा करते हैं।
सॉफ़्टवेयर
उपकरण के साथ लगे छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कई स्क्रीनों का विश्लेषण किया जाता है, जो टर्नकी समाधान प्रदान करता है। तृतीय-पक्ष सॉफ़्टवेयर विकल्पों का उपयोग अक्सर विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण स्क्रीन के लिए किया जाता है या जहां प्रयोगशाला या सुविधा में कई उपकरण होते हैं और ल विश्लेषण प्लेटफ़ॉर्म पर मानकीकरण करना चाहते हैं। हालाँकि, कुछ उपकरण सॉफ़्टवेयर छवियों और डेटा का थोक आयात और निर्यात प्रदान करते हैं, उन उपयोगकर्ताओं के लिए जो तृतीय-पक्ष सॉफ़्टवेयर के उपयोग के बिना ल विश्लेषण प्लेटफ़ॉर्म पर ऐसा मानकीकरण करना चाहते हैं।
अनुप्रयोग
यह तकनीक (बहुत) बड़ी संख्या में प्रयोग करने की अनुमति देती है, जिससे शोधपूर्ण स्क्रीनिंग की अनुमति मिलती है। सेल-आधारित सिस्टम का उपयोग मुख्य रूप से रासायनिक आनुवंशिकी में किया जाता है जहां बड़े, विविध अल्प अणु संग्रह को सेलुलर मॉडल सिस्टम पर उनके प्रभाव के लिए व्यवस्थित रूप से परीक्षण किया जाता है। हजारों अणुओं की स्क्रीन का उपयोग करके नवीन औषधिएं पाई जा सकती हैं, और इनमें औषधि विकास के भविष्य की संभावनाएं हैं। औषधि की शोध से परे, रासायनिक आनुवंशिकी का उद्देश्य अल्प अणुओं की पहचान करके जीनोम को क्रियाशील बनाना है जो कोशिका में 21,000 जीन उत्पादों में से अधिकांश पर कार्य करता है। उच्च-सामग्री प्रौद्योगिकी इस प्रयास का हिस्सा होगी जो यह सीखने के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान कर सकती है कि प्रोटीन कहाँ और कब रासायनिक रूप से नष्ट करके कार्य करते हैं। यह जीन के लिए सबसे उपयोगी होगा जहां नॉक आउट चूहों ( या कई जीन गायब) का निर्माण नहीं किया जा सकता है क्योंकि विकास, विकास या अन्यथा घातक होने के लिए प्रोटीन की आवश्यकता होती है। केमिकल नॉक आउट यह पता लगा सकता है कि ये जीन कैसे और कहाँ काम करते हैं। इसके अतिरिक्त प्रौद्योगिकी का उपयोग आरएनएआई के साथ संयोजन में विशिष्ट तंत्रों में सम्मिलित जीन के सेट की पहचान करने के लिए किया जाता है, उदाहरण के लिए कोशिका विभाजन। यहां, लक्ष्य जीव के जीनोम के अंदर पूर्वानुमानित जीनों के पूरे सेट को कवर करने वाले आरएनएआई के पुस्तकालयों का उपयोग प्रासंगिक उपसमूहों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जिससे जीन की एनोटेशन की सुविधा मिलती है जिसके लिए पहले से कोई स्पष्ट भूमिका स्थापित नहीं की गई है। स्वचालित कोशिका जीव विज्ञान द्वारा उत्पादित बड़े डेटासेट में स्थानिक रूप से हल किया गया, मात्रात्मक डेटा होता है जिसका उपयोग सिस्टम स्तर के मॉडल और कोशिकाओं और जीवों के कार्य करने के सिमुलेशन के निर्माण के लिए किया जा सकता है। सेल फ़ंक्शन के सिस्टम बायोलॉजी मॉडल यह भविष्यवाणी करने की अनुमति देंगे कि सेल बाहरी परिवर्तनों, विकास और बीमारी पर क्यों, कहां और कैसे प्रतिक्रिया करता है।
इतिहास
उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग तकनीक अक्षुण्ण जैविक प्रणालियों में कई जैव रासायनिक और रूपात्मक पैरामीटरों के मूल्यांकन की अनुमति देती है।
कोशिका-आधारित दृष्टिकोणों के लिए स्वचालित कोशिका जीव विज्ञान की उपयोगिता के लिए इस बात की जांच की आवश्यकता होती है कि स्वचालन और वस्तुनिष्ठ माप कैसे प्रयोग और रोग की समझ को बेहतर बना सकते हैं। सबसे पहले, यह कोशिका जीव विज्ञान अनुसंधान के अधिकांश, किन्तु सभी नहीं, पहलुओं में अन्वेषक के प्रभाव को हटा देता है और दूसरा, यह पूरी तरह से नए दृष्टिकोण को संभव बनाता है।
समीक्षा में, शास्त्रीय 20वीं सदी के कोशिका जीव विज्ञान ने संस्कृति में विकसित कोशिका रेखाओं का उपयोग किया जहां प्रयोगों को यहां वर्णित के समान ही मापा गया था, किन्तु वहां अन्वेषक ने इस पर चुनाव किया कि क्या मापा जाए और कैसे मापा जाए। 1990 के दशक की शुरुआत में, अनुसंधान के लिए चार्ज-युग्मित डिवाइस कैमरे (चार्ज युग्मित डिवाइस कैमरे) के विकास ने कोशिकाओं के चित्रों में विशेषताओं को मापने का अवसर पैदा किया- जैसे कि नाभिक में कितना प्रोटीन है, कितना बाहर है। जल्द ही नए फ्लोरोसेंट अणुओं का उपयोग करके परिष्कृत माप किए गए, जिनका उपयोग दूसरा संदेशवाहक सांद्रता या आंतरिक सेल डिब्बों के पीएच जैसे सेल गुणों को मापने के लिए किया जाता है। हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जेलीफ़िश के प्राकृतिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन अणु के व्यापक उपयोग ने कोशिका जीव विज्ञान में मुख्यधारा की तकनीक के रूप में सेल इमेजिंग की ओर रुझान को तेज कर दिया। इन प्रगतियों के बावजूद, किस सेल की छवि बनानी है और कौन सा डेटा प्रस्तुत करना है और इसका विश्लेषण कैसे करना है, इसका चयन अभी भी अन्वेषक द्वारा किया गया था।
सादृश्य से, यदि कोई फुटबॉल मैदान और उसके पार रखी खाने की प्लेटों की कल्पना करता है, तो उन सभी को देखने के बजाय, अन्वेषक स्कोर रेखा के पास मुट्ठी भर प्लेटें चुन लेगा और बाकी को छोड़ना होगा। इस सादृश्य में क्षेत्र टिशू कल्चर डिश है, जिस पर प्लेटें कोशिकाएं बढ़ती हैं। जबकि यह उचित और व्यावहारिक दृष्टिकोण था, पूरी प्रक्रिया का स्वचालन और विश्लेषण जीवित कोशिकाओं की पूरी आपश्चाती का विश्लेषण संभव बनाता है, इसलिए पूरे फुटबॉल मैदान को मापा जा सकता है।
यह भी देखें
- औषधिओं की शोध
- उच्च परिणाम स्क्रीनिंग
- औषधि की शोध ने नेतृत्व को प्रभावित किया
- माइक्रोस्कोपी
- फ़्लो साइटॉमेट्री
- लाइव ल-कोशिका इमेजिंग
संदर्भ
- ↑ Haney SA, ed. (2008). उच्च सामग्री स्क्रीनिंग: विज्ञान, तकनीक और अनुप्रयोग. New York: Wiley-Interscience. ISBN 978-0-470-03999-1.
- ↑ Giuliano KA, Haskins JR, ed. (2010). उच्च सामग्री स्क्रीनिंग: सिस्टम सेल बायोलॉजी और ड्रग डिस्कवरी के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण. Totowa, NJ: Humana Press. ISBN 978-1-61737-746-4.
- ↑ Gasparri F (June 2009). "एचसीएस में सेल फेनोटाइप का अवलोकन: सीमाएं और फायदे". Expert Opinion on Drug Discovery. 4 (6): 643–657. doi:10.1517/17460440902992870. PMID 23489157. S2CID 10771109.
- ↑ Cite error: Invalid
<ref>tag; no text was provided for refs namedVarma2011 - ↑ Proll G, Steinle L, Pröll F, Kumpf M, Moehrle B, Mehlmann M, Gauglitz G (August 2007). "उच्च-सामग्री-स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों में लेबल-मुक्त पहचान की क्षमता". J Chromatogr A. 1161 (1–2): 2–8. doi:10.1016/j.chroma.2007.06.022. PMID 17612548.
- ↑ Burdine L, Kodadek T (May 2004). "Target identification in chemical genetics: The (often) missing link". Chem. Biol. 11 (5): 593–7. doi:10.1016/j.chembiol.2004.05.001. PMID 15157870.
- ↑ Eggert US, Mitchison TJ (June 2006). "इमेजिंग द्वारा छोटे अणु की स्क्रीनिंग". Curr Opin Chem Biol. 10 (3): 232–7. doi:10.1016/j.cbpa.2006.04.010. PMID 16682248.
अग्रिम पठन
- Abraham VC, Taylor DL, Haskins JR (January 2004). "High content screening applied to large-scale cell biology". Trends Biotechnol. 22 (1): 15–22. doi:10.1016/j.tibtech.2003.10.012. PMID 14690618.
- Bleicher KH, Böhm HJ, Müller K, Alanine AI (May 2003). "Hit and lead generation: beyond high-throughput screening". Nat Rev Drug Discov. 2 (5): 369–78. doi:10.1038/nrd1086. PMID 12750740. S2CID 4859609.
- Burdine L, Kodadek T (May 2004). "Target identification in chemical genetics: the (often) missing link". Chem. Biol. 11 (5): 593–7. doi:10.1016/j.chembiol.2004.05.001. PMID 15157870.
- Carpenter AE, Sabatini DM (January 2004). "Systematic genome-wide screens of gene function". Nat. Rev. Genet. 5 (1): 11–22. doi:10.1038/nrg1248. PMID 14708012. S2CID 637682.
- Omta WA (January 2020). Knowledge Discovery in High Content Screening (Thesis). Utrecht University. doi:10.33540/198. ISBN 978-90-393-7283-8.
- Edwards BS, Oprea T, Prossnitz ER, Sklar LA (August 2004). "Flow cytometry for high-throughput, high-content screening". Curr Opin Chem Biol. 8 (4): 392–8. doi:10.1016/j.cbpa.2004.06.007. PMID 15288249.
- Xu GW, Mawji IA, Macrae CJ, Koch CA, Datti A, Wrana JL, Dennis JW, Schimmer AD (March 2008). "A high-content chemical screen identifies ellipticine as a modulator of p53 nuclear localization". Apoptosis. 13 (3): 413–22. doi:10.1007/s10495-007-0175-4. PMID 18181020. S2CID 8321422.
- Giuliano KA, Haskins JR, Taylor DL (August 2003). "Advances in high content screening for drug discovery". Assay Drug Dev Technol. 1 (4): 565–77. doi:10.1089/154065803322302826. PMID 15090253.
- Liszewski, Kathy (2014). "High Content Analysis: The 'Just Right' Solution". Gen. Eng. Biotechnol. News. 34 (3).
- Milligan G (July 2003). "High-content assays for ligand regulation of G-protein-coupled receptors". Drug Discov. Today. 8 (13): 579–85. doi:10.1016/S1359-6446(03)02738-7. PMID 12850333.
- Battich N, Stoeger T, Pelkmans L (October 2013). "Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution". Nature Methods. 10 (11): 1127–1133. doi:10.1038/nmeth.2657. PMID 24097269. S2CID 17472560.
