पूरक डीएनए: Difference between revisions

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परीक्षण में प्रयुक्त cDNA डीएनए माइक्रोएरे से आउटपुट

आनुवंशिकी में, पूरक डीएनए ( cDNA) एंजाइम विपरीत प्रतिलेखन द्वारा उत्प्रेरित प्रतिक्रिया में एकल सज्जित आरएनए (उदाहरण के लिए, मैसेंजर आरएनए (mRNA) या माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए)) टेम्पलेट से संश्लेषित डीएनए है।[1] cDNA का उपयोग प्रायः कोशिका में एक विशिष्ट प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए किया जाता है जो सामान्यतः उस प्रोटीन को व्यक्त नहीं करता है (यानी, विषम अभिव्यक्ति), या डीएनए-आधारित तरीकों (क्यूपीसीआर, आरएनए-सीक्यू) का उपयोग करके mRNA अणुओं को अनुक्रमित या मात्राबद्ध करने के लिए। cDNA जो एक विशिष्ट प्रोटीन के लिए कोड करता है, उसे अभिव्यक्ति के लिए प्राप्तकर्ता कोशिका में स्थानांतरित किया जा सकता है, प्रायः बैक्टीरिया या यीस्ट अभिव्यक्ति प्रणालियों में। cDNA को माइक्रोएरे, क्यूपीसीआर, और आरएनए-सीक्यू जैसे परीक्षणों में थोक ऊतक, एकल कोशिकाओं या एकल नाभिक में ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए भी तैयार किया जाता है।

cDNA भी स्वाभाविक रूप से रेट्रोवायरस ( जैसे एचआईवी -1, एचआईवी-2, सिमियन प्रतिरक्षण वायरस, आदि (द्वारा निर्मित होता है और फिर मेजबान के जीनोम में एकीकृत होता है, जहां यह प्रोवायरस बनाता है।)[2] cDNA शब्द का प्रयोग, सामान्यतः जैव सूचना विज्ञान के संदर्भ में, mRNA प्रतिलेख के अनुक्रम को संदर्भित करने के लिए किया जाता है, जिसे आरएनए बेस (जीसीएयू) के बजाय डीएनए बेस (डीऑक्सी-जीसीएटी) के रूप में व्यक्त किया जाता है।

cDNA की पेटेंट क्षमता एसोसिएशन फॉर मॉलिक्यूलर पैथोलॉजी वी में 2013 के यूएस सुप्रीम कोर्ट के निर्णय का विषय थी। असंख्य आनुवंशिकी, इंक,. अनुबंध के रूप में, अदालत ने घोषणा की, कि एक्सॉन-ओनली cDNA पेटेंट-योग्य है, जबकि स्वाभाविक रूप से होने वाले डीएनए के अलग-अलग अनुक्रमों में आंतरिक नहीं हैं।

संश्लेषण

आरएनए cDNA संश्लेषण के लिए एक प्रारूप के रूप में कार्य करता है।[3] कोशिकीय जीवन में, cDNA वायरस और रेट्रोट्रांसपोन्स द्वारा आरएनए के एकीकरण के लिए लक्ष्य जीनोमिक डीएनए में उत्पन्न होता है। आणविक जीव विज्ञान में, जीनोमिक डीएनए, प्रोटीन और अन्य कोशिकीय घटकों को हटाने के बाद स्रोत सामग्री से आरएनए को शुद्ध किया जाता है। फिर cDNA को इन विट्रो विपरीत प्रतिलेखन के माध्यम से संश्लेषित किया जाता है।[4]

आरएनए शुद्धि

आरएनए को होस्ट कोशिकाओं में जीनोमिक डीएनए से लिया जाता है और पहले लिसिंग कोशिकाओं द्वारा निकाला जाता है, फिर फेनोल-क्लोरोफॉर्म, सिलिका कॉलम और बीएड-आधारित आरएनए निष्कर्षण तरीकों जैसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीकों का उपयोग करके आरएनए को शुद्ध किया जाता है।[5] निष्कर्षण विधि स्रोत सामग्री के आधार पर भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, पौधे के ऊतकों से आरएनए को निकालने के लिए अतिरिक्त अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, जैसे पॉलीविनाइलपिरॉलिडोन (पीवीपी), फेनोलिक यौगिकों, कार्बोहाइड्रेट और अन्य यौगिकों को हटाने के लिए जो अन्यथा आरएनए को असामान्य बना देंगे।[6] डीएनए और प्रोटीन को हटाने के लिए, डीनेज और प्रोटीनस के रूप में एंजाइम का उपयोग क्षरण के लिए किया जाता है।[7] महत्वपूर्ण विषय है, आरएनए अखंडता को कैनोट्रोपिक प्रतिरूपकों जैसे कि गुएनिडियम आइसोथियोसाइनेट, सोडियम डोडसाइल सल्फेट (एसडीएस), फेनोल या क्लोरोफॉर्म के साथ निष्क्रिय करके बनाए रखा जाता है। इसके बाद कुल आरएनए को अन्य सेलुलर घटकों से अलग कर दिया जाता है और शराब के साथ उत्पन्न किया जाता है। विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए सरल और त्वरित आरएनए निष्कर्षण के लिए विभिन्न वाणिज्यिक किट उपस्थित हैं।[8] अतिरिक्त बीएड-आधारित तरीकों का उपयोग आरएनए के विशिष्ट उप-प्रकार को अलग करने के लिए किया जा सकता है... (जैसे कि mRNA और माइक्रोआरएनए आकार या अद्वितीय आरएनए क्षेत्रों पर आधारित है।[9][10]

विपरीत प्रतिलेखन

प्रथम-चरण संश्लेषण

विपरीत प्रतिलेखन एंजाइम और शुद्ध आरएनए टेम्प्लेट का उपयोग करके, cDNA का एक स्ट्रैंड उत्पन्न किया जाता है (प्रथम-स्ट्रैंड cDNA संश्लेषण)। मोलोनी मुराइन ल्यूकेमिया वायरस से एम-एमएलवी विपरीत प्रतिलेखन का उपयोग सामान्यतः इसकी कम RNAs एच गतिविधि के कारण किया जाता है जो लंबे आरएनए के ट्रांसक्रिप्शन के लिए अनुकूल है।[11] एवियन मायलोब्लास्टोसिस वायरस से प्राप्त एएमवी विपरीत प्रतिलेखन का उपयोग मजबूत माध्यमिक संरचनाओं (यानी उच्च पिघलने वाले तापमान) वाले आरएनए टेम्पलेट्स के लिए भी किया जा सकता है।[12] cDNA सामान्यतः RT-qPCR और RNA-seq जैसे जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए mRNA से उत्पन्न होता है।[13] mRNA को ऑलिगो-डीटी प्राइमरों का उपयोग करके चुनिंदा रूप से रिवर्स ट्रांसक्राइब किया जाता है, जो सभी mRNA के 3' सिरे पर पॉली-एडिनाइलेटेड टेल के रिवर्स पूरक हैं। ऑलिगो-डीटी और रैंडम हेक्सामर प्राइमरों का एक अनुकूलित मिश्रण 5' या 3' पूर्वाग्रह को कम करते हुए पूर्ण-लंबाई cDNA प्राप्त करने की संभावना बढ़ाता है।[14] राइबोसोमल आरएनए भी mRNA और गैर-पॉली-एडिनाइलेटेड ट्रांस्क्रिप्ट जैसे कुछ गैर-कोडिंग आरएनए को समृद्ध करने के लिए समाप्त हो सकता है।[15]

द्वितीय-चरण संश्लेषण

प्रथम-चरण संश्लेषण के परिणाम, आरएनए-डीएनए संकर, को कई दूसरे-स्ट्रैंड संश्लेषण तरीकों के माध्यम से संसाधित किया जा सकता है या सीधे डाउनस्ट्रीम परख में संसाधित किया जा सकता है।[16][17] हेयरपिन-प्राइमेड सिंथेसिस के रूप में जानी जाने वाली एक प्रारंभिक विधि प्रथम-स्ट्रैंड cDNA के 3' सिरे पर हेयरपिन के गठन से लेकर प्राइम सेकेंड-स्ट्रैंड संश्लेषण तक पर निर्भर थी। हालाँकि, प्राइमिंग यादृच्छिक होती है और हेयरपिन हाइड्रोलिसिस से जानकारी की हानि होती है। गबलर और हॉफमैन प्रक्रिया में mRNA को निकेल करने के लिए ई. कोली आरएनएज़ एच का उपयोग किया जाता है जिसे ई. कोली डीएनए पॉलीमरेज़ से बदल दिया जाता है और ई. कोली डीएनए संयुक्ताक्षर से सीलबंद कर दिया जाता है। इस प्रक्रिया का अनुकूलन एम-एमएलवी की कम RNAs एच गतिविधि पर निर्भर करता है ताकि शेष आरएनए को निक mRNA के साथ जोड़ा जा सके, जिसे बाद में दूसरे-स्ट्रैंड cDNA के डीएनए पॉलीमरेज़ अनुवाद के बाद RNAs एच जोड़कर हटा दिया जाता है। यह mRNA के 5 'अंत में नष्ट अनुक्रम जानकारी को रोकता है.

अनुप्रयोग

पूरक डीएनए का उपयोग प्रायः जीन प्रतिरूपण या जीन जांच के रूप में या cDNA श्रम के निर्माण में किया जाता है। जब वैज्ञानिक प्राप्तकर्ता कोशिका में प्रोटीन के रूप में नई आनुवंशिक सामग्री को व्यक्त करने के लिए एक कोशिका से दूसरे कोशिका में एक जीन स्थानांतरित करते हैं, cDNA को पूरे जीन के परिणामस्वरूप प्राप्तकर्ता (में जोड़ा जाएगा), क्योंकि पूरे जीन के डीएनए में डीएनए सम्मिलित हो सकता है जो प्रोटीन के लिए कोड नहीं करता है या जो प्रोटीन के कोडिंग अनुक्रम को बाधित करता है (जैसे, इंट्रोन्स)। cDNA के आंशिक अनुक्रमों को प्रायः व्यक्त अनुक्रम परीक्षण के रूप में प्राप्त किया जाता है।

बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया के माध्यम से डीएनए अनुक्रमों के प्रवर्धन के साथ (पीसीआर) अब सामान्यतः, प्रारंभिक चरण के रूप में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन का संचालन करेगा, अंतरा-कोशिकीय अभिव्यक्ति के लिए cDNA का सटीक अनुक्रम प्राप्त करने के लिए पीसीआर द्वारा अनुसरण किया जाता है. यह अनुक्रम-विशिष्ट डीएनए प्राइमरों को डिजाइन करके प्राप्त किया जाता है जो प्रोटीन के लिए cDNA क्षेत्र कोडिंग के 5 'और 3' छोरों को संकरण करते हैं. बार प्रवर्धित होने के बाद, अनुक्रम को प्रत्येक छोर पर नाभिक के साथ काटा जा सकता है और अभिव्यक्ति वैक्टर के रूप में ज्ञात कई छोटे परिपत्र डीएनए अनुक्रमों में से एक में सम्मिलित किया जा सकता है।. ऐसे वैक्टर कोशिकाओं के अंदर, और मेजबान डीएनए में संभावित एकीकरण के लिए आत्म-प्रतिकृति की अनुमति देते हैं. वे सामान्यतः एमडीएनए के प्रतिलेखन को mRNA में चलाने के लिए एक दृढ़ प्रवर्तक भी होते हैं, जिसे बाद में प्रोटीन में अनुवादित किया जाता है.

cDNA का उपयोग RNA-seq या RT-qPCR जैसे तरीकों के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए भी किया जाता है।[18][19][20] अनुक्रमण के लिए, आरएनए को अनुक्रमण मंच आकार सीमाओं के कारण खंडित किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, दूसरे-स्ट्रैंड संश्लेषित cDNA को एडेप्टर के साथ लिगेट किया जाना चाहिए जो cDNA टुकड़ों को पीसीआर प्रवर्धित करने और अनुक्रमण प्रवाह कोशिकाओं को जोड़ने की अनुमति देता है। जीन-विशिष्ट विश्लेषण विधियां सामान्यतः फ्लोरोमेट्रिक और अन्य तरीकों के माध्यम से cDNA के स्तर को निर्धारित करने के लिए माइक्रोएरे और RT-qPCR का उपयोग करती हैं।

13 जून 2013 को, संयुक्त राज्य अमेरिका के सुप्रीम कोर्ट ने एसोसिएशन फॉर आणविक पैथोलॉजी वी के संबंध में निर्णय सुनाया। असंख्य आनुवंशिकी कि स्वाभाविक रूप से होने वाले जीन को पेटेंट नहीं किया जा सकता है, cDNA पेटेंट-योग्य है क्योंकि यह स्वाभाविक रूप से नहीं होता है।[21]

वायरस और रेट्रोट्रांसपोसन्स

कुछ वायरस अपने वायरल आरएनए को mRNA (वायरल आरएनए → cDNA → mRNA) में बदलने के लिए cDNA का उपयोग करते हैं। mRNA का उपयोग मेजबान सेल को संभालने के लिए वायरल प्रोटीन बनाने के लिए किया जाता है

वायरल आरएनए से cDNA तक इस पहले चरण का एक उदाहरण एचआईवी संक्रमण चक्र में देखा जा सकता है। यहां, मेजबान कोशिका झिल्ली वायरस के लिपिड लिफाफे से जुड़ जाती है जो वायरल कैप्सिड को वायरल जीनोम आरएनए की दो प्रतियों के साथ मेजबान में प्रवेश करने की अनुमति देती है। फिर cDNA प्रतिलिपि वायरल आरएनए के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के माध्यम से बनाई जाती है, यह एक प्रक्रिया है जो चैपरोन सीवाईपीए और एक वायरल कैप्सिड से जुड़े रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस द्वारा सुगम होती है।[22]

cDNA भी यूकेरियोटिक जीनोम में पूर्वव्यापी ट्रान्सपोन्स द्वारा उत्पन्न होता है। रेट्रोट्रांसपोसन मोबाइल आनुवंशिक तत्व हैं जो आरएनए मध्यवर्ती के माध्यम से खुद को और कभी-कभी जीनोम के बीच स्थानांतरित करते हैं। यह तंत्र संक्रामक कणों की पीढ़ी के बहिष्करण के साथ वायरस के साथ साझा किया जाता है।[23][24]

यह भी देखें

  • cDNA लाइब्रेरी – डीएनए लाइब्रेरी का प्रकार
  • cDNA माइक्रोएरे – ठोस सतह से जुड़े सूक्ष्म डीएनए स्पॉट का संग्रह
  • RNA-Seq – कोशिकीय जीव विज्ञान में लैब तकनीक
  • रीयल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन – आणविक जीव विज्ञान की प्रयोगशाला तकनीक (RT-qPCR)

संदर्भ

Mark D. Adams et al. “Complementary DNA Sequencing: Expressed Sequence Tags and Human Genome Project.” Science (American Association for the Advancement of Science) 252.5013 (1991): 1651–1656. Web.

Philip M. Murphy, and H. Lee Tiffany. “Cloning of Complementary DNA Encoding a Functional Human Interleukin-8 Receptor.” Science (American Association for the Advancement of Science) 253.5025 (1991): 1280–1283. Web.

  1. ↑ Hastings, P. J. (2001-01-01), "Complementary DNA (cDNA)", in Brenner, Sydney; Miller, Jefferey H. (eds.), Encyclopedia of Genetics (in English), New York: Academic Press, p. 433, ISBN 978-0-12-227080-2, retrieved 2022-11-29
  2. ↑ Croy, Ron. "आणविक आनुवंशिकी II - जेनेटिक इंजीनियरिंग कोर्स (अनुपूरक नोट)". Durham University durham.ac.uk; 20 April 1998. Archived from the original on 24 August 2002. Retrieved 4 February 2015.
  3. ↑ Ying, Shao-Yao (1 July 2004). "पूरक डीएनए पुस्तकालय". Molecular Biotechnology (in English). 27 (3): 245–252. doi:10.1385/MB:27:3:245. ISSN 1559-0305. PMID 15247497. S2CID 25600775.
  4. ↑ "5 Steps to Optimal cDNA Synthesis - US". www.thermofisher.com (in English). Retrieved 12 May 2020.
  5. ↑ Tavares, Lucélia; Alves, Paula M.; Ferreira, Ricardo B.; Santos, Claudia N. (6 January 2011). "एसके-एन-एमसी न्यूरोब्लास्टोमा से डीएनए मुक्त आरएनए अलगाव के लिए विभिन्न तरीकों की तुलना". BMC Research Notes. 4 (1): 3. doi:10.1186/1756-0500-4-3. ISSN 1756-0500. PMC 3050700. PMID 21211020.
  6. ↑ R, Kansal; K, Kuhar; I, Verma; Rn, Gupta; Vk, Gupta; Kr, Koundal (December 2008). "पॉलीफेनोल्स और पॉलीसेकेराइड रिच प्लांट टिश्यू से आरएनए अलगाव की बेहतर और सुविधाजनक विधि". Indian Journal of Experimental Biology (in English). 46 (12): 842–5. PMID 19245182.
  7. ↑ I, Vomelová; Z, Vanícková; A, Sedo (2009). "आरएनए शुद्धिकरण के तरीके। सभी तरीके (चाहिए) रोम की ओर ले जाते हैं". Folia Biologica (in English). 55 (6): 243–51. PMID 20163774.
  8. ↑ Sellin Jeffries, Marlo K.; Kiss, Andor J.; Smith, Austin W.; Oris, James T. (14 November 2014). "छोटे ऊतक नमूनों से कुल आरएनए के अलगाव के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित और मैन्युअल निष्कर्षण किट की तुलना". BMC Biotechnology. 14 (1): 94. doi:10.1186/s12896-014-0094-8. ISSN 1472-6750. PMC 4239376. PMID 25394494.
  9. ↑ "mRNA Isolation with Dynabeads in 15 minutes - US". www.thermofisher.com (in English). Retrieved 20 May 2020.
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  11. ↑ Haddad, Fadia; Baldwin, Kenneth M. (2010), King, Nicola (ed.), "Reverse Transcription of the Ribonucleic Acid: The First Step in RT-PCR Assay", RT-PCR Protocols: Second Edition, Methods in Molecular Biology (in English), Humana Press, vol. 630, pp. 261–270, doi:10.1007/978-1-60761-629-0_17, ISBN 978-1-60761-629-0, PMID 20301003
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बाहरी संबंध

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