सीआरआईएसपीआर व्यतिकरण: Difference between revisions

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सीआरआईएसपीआर हस्तक्षेप (सीआरआईएसपीआरआई) आनुवंशिक गड़बड़ी तकनीक है जो [[प्रोकार्योटिक]] और [[यूकेरियोटिक]] कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के अनुक्रम-विशिष्ट दमन की अनुमति देती है।<ref>{{cite journal | vauthors = Jensen TI, Mikkelsen NS, Gao Z, Foßelteder J, Pabst G, Axelgaard E, Laustsen A, König S, Reinisch A, Bak RO | display-authors = 6 | title = CRISPRa और CRISPRi का उपयोग करके प्राथमिक कोशिकाओं में प्रतिलेखन का लक्षित विनियमन| journal = Genome Research | volume = 31 | issue = 11 | pages = 2120–2130 | date = November 2021 | pmid = 34407984 | pmc = 8559706 | doi = 10.1101/gr.275607.121 }}</ref> इसे सबसे पहले स्टेनली क्यूई और [[वेंडेल लिम]], एडम आर्किन, [[जोनाथन वीसमैन]] और [[जेनिफ़र डौडना]] की प्रयोगशालाओं में उनके सहयोगियों द्वारा विकसित किया गया था।<ref name="pmid23452860">{{cite journal | vauthors = Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, Doudna JA, Weissman JS, Arkin AP, Lim WA | title = जीन अभिव्यक्ति के अनुक्रम-विशिष्ट नियंत्रण के लिए सीआरआईएसपीआर को आरएनए-निर्देशित मंच के रूप में पुन: उपयोग करना| journal = Cell | volume = 152 | issue = 5 | pages = 1173–1183 | date = February 2013 | pmid = 23452860 | pmc = 3664290 | doi = 10.1016/j.cell.2013.02.022 }}</ref> जीन अभिव्यक्ति का अनुक्रम-विशिष्ट सक्रियण [[dCas9 सक्रियण प्रणाली]] [[CRISPR]] सक्रियण (CRISPRa) को संदर्भित करता है।


जीवाणु आनुवंशिक प्रतिरक्षा प्रणाली पर आधारित - सीआरआईएसपीआर (क्लस्टर नियमित रूप से अंतराल वाले छोटे पैलिंड्रोमिक दोहराव) मार्ग,<ref name="pmid17379808">{{cite journal | vauthors = Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P | display-authors = 6 | title = सीआरआईएसपीआर प्रोकैरियोट्स में वायरस के खिलाफ अर्जित प्रतिरोध प्रदान करता है| journal = Science | volume = 315 | issue = 5819 | pages = 1709–1712 | date = March 2007 | pmid = 17379808 | doi = 10.1126/science.1138140 | hdl-access = free | s2cid = 3888761 | bibcode = 2007Sci...315.1709B | hdl = 20.500.11794/38902 }}</ref> तकनीक [[आरएनए हस्तक्षेप]] के लिए पूरक दृष्टिकोण प्रदान करती है। हालाँकि, CRISPRi और RNAi के बीच अंतर यह है कि CRISPRi मुख्य रूप से ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, जबकि RNAi mRNA स्तर पर जीन को नियंत्रित करता है।
'''सीआरआईएसपीआर व्यतिकरण''' (सीआरआईएसपीआरआई) आनुवंशिक व्याकुलता तकनीक है जो की [[प्रोकार्योटिक|प्रोकैरियोटिक]] और [[यूकेरियोटिक]] कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के अनुक्रम-विशिष्ट दमन की अनुमति देती है।<ref>{{cite journal | vauthors = Jensen TI, Mikkelsen NS, Gao Z, Foßelteder J, Pabst G, Axelgaard E, Laustsen A, König S, Reinisch A, Bak RO | display-authors = 6 | title = CRISPRa और CRISPRi का उपयोग करके प्राथमिक कोशिकाओं में प्रतिलेखन का लक्षित विनियमन| journal = Genome Research | volume = 31 | issue = 11 | pages = 2120–2130 | date = November 2021 | pmid = 34407984 | pmc = 8559706 | doi = 10.1101/gr.275607.121 }}</ref> और इसे सर्वप्रथम स्टेनली क्यूई और [[वेंडेल लिम]], एडम आर्किन, [[जोनाथन वीसमैन]] और [[जेनिफ़र डौडना]] की प्रयोगशालाओं में उनके सहयोगियों द्वारा विकसित किया गया था।<ref name="pmid23452860">{{cite journal | vauthors = Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, Doudna JA, Weissman JS, Arkin AP, Lim WA | title = जीन अभिव्यक्ति के अनुक्रम-विशिष्ट नियंत्रण के लिए सीआरआईएसपीआर को आरएनए-निर्देशित मंच के रूप में पुन: उपयोग करना| journal = Cell | volume = 152 | issue = 5 | pages = 1173–1183 | date = February 2013 | pmid = 23452860 | pmc = 3664290 | doi = 10.1016/j.cell.2013.02.022 }}</ref> अतः जीन अभिव्यक्ति का अनुक्रम-विशिष्ट [[dCas9 सक्रियण प्रणाली|सक्रियण]] [[dCas9 सक्रियण प्रणाली|सीआरआईएसपीआर]] सक्रियण [[CRISPR|(सीआरआईएसपीआरए)]] को संदर्भित करता है।  


==पृष्ठभूमि==
इस प्रकार से जीवाणु आनुवंशिक प्रतिरक्षा प्रणाली पर आधारित-सीआरआईएसपीआर (संकुल नियमित रूप से अंतराल वाले छोटे पैलिंड्रोमिक दोहराव) मार्ग पर आधारित है।<ref name="pmid17379808">{{cite journal | vauthors = Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P | display-authors = 6 | title = सीआरआईएसपीआर प्रोकैरियोट्स में वायरस के खिलाफ अर्जित प्रतिरोध प्रदान करता है| journal = Science | volume = 315 | issue = 5819 | pages = 1709–1712 | date = March 2007 | pmid = 17379808 | doi = 10.1126/science.1138140 | hdl-access = free | s2cid = 3888761 | bibcode = 2007Sci...315.1709B | hdl = 20.500.11794/38902 }}</ref> और तकनीक [[आरएनए हस्तक्षेप|आरएनए व्यतिकरण]] के लिए पूरक दृष्टिकोण प्रदान करती है। चूंकि, सीआरआईएसपीआरआई और आरएनएआई के मध्य अंतर यह है कि सीआरआईएसपीआरआई मुख्य रूप से ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, जबकि आरएनएआई एमआरएनए स्तर पर जीन को नियंत्रित करता है।
{{see also|CRISPR|CRISPR gene editing}}
कई [[ जीवाणु |जीवाणु]] और अधिकांश [[आर्किया]] में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली होती है जिसमें सीआरआईएसपीआर आरएनए (सीआरएनए) और सीआरआईएसपीआर-संबद्ध (कैस) जीन शामिल होते हैं।


CRISPR हस्तक्षेप (CRISPRi) तकनीक की रिपोर्ट सबसे पहले 2013 की शुरुआत में [[सैन फ्रांसिस्को में कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय]] के लेई एस. क्यूई और शोधकर्ताओं द्वारा की गई थी।<ref name="pmid23452860"/> प्रौद्योगिकी उत्प्रेरक रूप से मृत [[Cas9]] (आमतौर पर dCas9 के रूप में चिह्नित) प्रोटीन का उपयोग करती है जिसमें आरएनए-निर्देशित तरीके से जीन को विनियमित करने के लिए एंडोन्यूक्लिज़ गतिविधि का अभाव होता है। लक्ष्यीकरण विशिष्टता जीनोमिक लोकस के लिए एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) की पूरक आधार-पेयरिंग द्वारा निर्धारित की जाती है। एसजीआरएनए काइमेरिक नॉनकोडिंग आरएनए है जिसे तीन क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है: 20 एनटी बेस-पेयरिंग अनुक्रम, 42 एनटी डीसीएएस9-बाइंडिंग हेयरपिन और 40 एनटी टर्मिनेटर (बैक्टीरिया,<ref name="pmid23360965">{{cite journal | vauthors = Jiang W, Bikard D, Cox D, Zhang F, Marraffini LA | title = सीआरआईएसपीआर-कैस सिस्टम का उपयोग करके बैक्टीरिया जीनोम का आरएनए-निर्देशित संपादन| journal = Nature Biotechnology | volume = 31 | issue = 3 | pages = 233–239 | date = March 2013 | pmid = 23360965 | pmc = 3748948 | doi = 10.1038/nbt.2508 }}</ref><ref name="pmid27238023">{{cite journal | vauthors = Peters JM, Colavin A, Shi H, Czarny TL, Larson MH, Wong S, Hawkins JS, Lu CH, Koo BM, Marta E, Shiver AL, Whitehead EH, Weissman JS, Brown ED, Qi LS, Huang KC, Gross CA | display-authors = 6 | title = बैक्टीरिया में आवश्यक जीन का एक व्यापक, सीआरआईएसपीआर-आधारित कार्यात्मक विश्लेषण| journal = Cell | volume = 165 | issue = 6 | pages = 1493–1506 | date = June 2016 | pmid = 27238023 | pmc = 4894308 | doi = 10.1016/j.cell.2016.05.003 }}</ref><ref name="pmid27996021">{{cite journal | vauthors = Li XT, Jun Y, Erickstad MJ, Brown SD, Parks A, Court DL, Jun S | title = tCRISPRi: tunable and reversible, one-step control of gene expression | journal = Scientific Reports | volume = 6 | pages = 39076 | date = December 2016 | pmid = 27996021 | pmc = 5171832 | doi = 10.1038/srep39076 | bibcode = 2016NatSR...639076L }}</ref> ख़मीर,<ref name="pmid23460208">{{cite journal | vauthors = DiCarlo JE, Norville JE, Mali P, Rios X, Aach J, Church GM | title = CRISPR-Cas सिस्टम का उपयोग करके Saccharomyces cerevisiae में जीनोम इंजीनियरिंग| journal = Nucleic Acids Research | volume = 41 | issue = 7 | pages = 4336–4343 | date = April 2013 | pmid = 23460208 | pmc = 3627607 | doi = 10.1093/nar/gkt135 }}</ref> फल मक्खियाँ,<ref name="pmid2408874">{{cite journal | vauthors = Gratz SJ, Cummings AM, Nguyen JN, Hamm DC, Donohue LK, Harrison MM, Wildonger J, O'Connor-Giles KM | display-authors = 6 | title = Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease | journal = Genetics | volume = 194 | issue = 4 | pages = 1029–1035 | date = August 2013 | pmid = 23709638 | pmc = 3730909 | doi = 10.1534/genetics.113.152710 }}</ref> जेब्राफिश,<ref name="pmid23360964">{{cite journal | vauthors = Hwang WY, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, Peterson RT, Yeh JR, Joung JK | display-authors = 6 | title = CRISPR-Cas प्रणाली का उपयोग करके जेब्राफिश में कुशल जीनोम संपादन| journal = Nature Biotechnology | volume = 31 | issue = 3 | pages = 227–229 | date = March 2013 | pmid = 23360964 | pmc = 3686313 | doi = 10.1038/nbt.2501 }}</ref> चूहे<ref name="pmid23643243">{{cite journal | vauthors = Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R | title = One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering | journal = Cell | volume = 153 | issue = 4 | pages = 910–918 | date = May 2013 | pmid = 23643243 | pmc = 3969854 | doi = 10.1016/j.cell.2013.04.025 }}</ref>).
==पृष्ठभूमि ==
{{see also|सीआरआईएसपीआर|सीआरआईएसपीआर जीन संपादन}}


सिंथेटिक एसजीआरएनए को डिजाइन करते समय, केवल 20 एनटी बेस-पेयरिंग अनुक्रम को संशोधित किया जाता है। माध्यमिक चर पर भी विचार किया जाना चाहिए: ऑफ-टार्गेट प्रभाव (जिसके लिए बेस-पेयरिंग अनुक्रम का सरल ब्लास्ट रन आवश्यक है), dCas9-बाइंडिंग हेयरपिन संरचना का रखरखाव, और यह सुनिश्चित करना कि संशोधित sgRNA में कोई प्रतिबंध साइट मौजूद नहीं है, क्योंकि इससे डाउनस्ट्रीम क्लोनिंग चरणों में समस्या उत्पन्न हो सकती है। एसजीआरएनए डिज़ाइन की सरलता के कारण, यह तकनीक जीनोम-वाइड स्केलिंग के लिए उत्तरदायी है।<ref name="pmid24136345">{{cite journal | vauthors = Larson MH, Gilbert LA, Wang X, Lim WA, Weissman JS, Qi LS | title = जीन अभिव्यक्ति के अनुक्रम-विशिष्ट नियंत्रण के लिए सीआरआईएसपीआर हस्तक्षेप (सीआरआईएसपीआरआई)।| journal = Nature Protocols | volume = 8 | issue = 11 | pages = 2180–2196 | date = November 2013 | pmid = 24136345 | pmc = 3922765 | doi = 10.1038/nprot.2013.132 }}</ref>
अनेक [[ जीवाणु |जीवाणु]] और अधिकांश [[आर्किया]] में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली होती है जिसमें सीआरआईएसपीआर आरएनए (सीआरएनए) और सीआरआईएसपीआर-संबद्ध (कैस) जीन सम्मिलित होते हैं।


CRISPRi उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय Cas9 की पीढ़ी पर निर्भर करता है। यह जीन एन्कोडिंग Cas9 के दो उत्प्रेरक अवशेषों (D10A और H840A) में बिंदु उत्परिवर्तन शुरू करके पूरा किया गया है।<ref name="pmid22745249">{{cite journal | vauthors = Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E | title = अनुकूली जीवाणु प्रतिरक्षा में एक प्रोग्रामयोग्य दोहरे आरएनए-निर्देशित डीएनए एंडोन्यूक्लिज़| journal = Science | volume = 337 | issue = 6096 | pages = 816–821 | date = August 2012 | pmid = 22745249 | pmc = 6286148 | doi = 10.1126/science.1225829 | bibcode = 2012Sci...337..816J }}</ref> ऐसा करने पर, dCas9 dsDNA को तोड़ने में असमर्थ है लेकिन डीएनए को लक्षित करने की क्षमता बरकरार रखता है। साथ में, sgRNA और dCas9 जीन-विशिष्ट विनियमन के लिए न्यूनतम प्रणाली का निर्माण करते हैं।<ref name="pmid23452860" />
सीआरआईएसपीआर व्यतिकरण (सीआरआईएसपीआरआई ) तकनीक की रिपोर्ट सर्वप्रथम 2013 की प्रारंभ में [[सैन फ्रांसिस्को में कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय]] के लेई एस. क्यूई और शोधकर्ताओं द्वारा की गई थी।<ref name="pmid23452860"/> प्रौद्योगिकी उत्प्रेरक रूप से मृत [[Cas9|सीएएस9]] (सामान्यतः डीसीएएस9 के रूप में चिह्नित) प्रोटीन का उपयोग करती है जिसमें आरएनए-निर्देशित विधियों से जीन को विनियमित करने के लिए एंडोन्यूक्लिज़ गतिविधि का अभाव होता है। इस प्रकार से लक्ष्यीकरण विशिष्टता जीनोमिक लोकस के लिए एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) की पूरक आधार-पेयरिंग द्वारा निर्धारित की जाती है। एसजीआरएनए काइमेरिक नॉनकोडिंग आरएनए है जिसे तीन क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है: अतः 20 एनटी बेस-पेयरिंग अनुक्रम, 42 एनटी डीसीएएस9-बाइंडिंग हेयरपिन और 40 एनटी टर्मिनेटर (बैक्टीरिया,<ref name="pmid23360965">{{cite journal | vauthors = Jiang W, Bikard D, Cox D, Zhang F, Marraffini LA | title = सीआरआईएसपीआर-कैस सिस्टम का उपयोग करके बैक्टीरिया जीनोम का आरएनए-निर्देशित संपादन| journal = Nature Biotechnology | volume = 31 | issue = 3 | pages = 233–239 | date = March 2013 | pmid = 23360965 | pmc = 3748948 | doi = 10.1038/nbt.2508 }}</ref><ref name="pmid27238023">{{cite journal | vauthors = Peters JM, Colavin A, Shi H, Czarny TL, Larson MH, Wong S, Hawkins JS, Lu CH, Koo BM, Marta E, Shiver AL, Whitehead EH, Weissman JS, Brown ED, Qi LS, Huang KC, Gross CA | display-authors = 6 | title = बैक्टीरिया में आवश्यक जीन का एक व्यापक, सीआरआईएसपीआर-आधारित कार्यात्मक विश्लेषण| journal = Cell | volume = 165 | issue = 6 | pages = 1493–1506 | date = June 2016 | pmid = 27238023 | pmc = 4894308 | doi = 10.1016/j.cell.2016.05.003 }}</ref><ref name="pmid27996021">{{cite journal | vauthors = Li XT, Jun Y, Erickstad MJ, Brown SD, Parks A, Court DL, Jun S | title = tCRISPRi: tunable and reversible, one-step control of gene expression | journal = Scientific Reports | volume = 6 | pages = 39076 | date = December 2016 | pmid = 27996021 | pmc = 5171832 | doi = 10.1038/srep39076 | bibcode = 2016NatSR...639076L }}</ref> ख़मीर,<ref name="pmid23460208">{{cite journal | vauthors = DiCarlo JE, Norville JE, Mali P, Rios X, Aach J, Church GM | title = CRISPR-Cas सिस्टम का उपयोग करके Saccharomyces cerevisiae में जीनोम इंजीनियरिंग| journal = Nucleic Acids Research | volume = 41 | issue = 7 | pages = 4336–4343 | date = April 2013 | pmid = 23460208 | pmc = 3627607 | doi = 10.1093/nar/gkt135 }}</ref> फल मक्खियाँ,<ref name="pmid2408874">{{cite journal | vauthors = Gratz SJ, Cummings AM, Nguyen JN, Hamm DC, Donohue LK, Harrison MM, Wildonger J, O'Connor-Giles KM | display-authors = 6 | title = Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease | journal = Genetics | volume = 194 | issue = 4 | pages = 1029–1035 | date = August 2013 | pmid = 23709638 | pmc = 3730909 | doi = 10.1534/genetics.113.152710 }}</ref> जेब्राफिश,<ref name="pmid23360964">{{cite journal | vauthors = Hwang WY, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, Peterson RT, Yeh JR, Joung JK | display-authors = 6 | title = CRISPR-Cas प्रणाली का उपयोग करके जेब्राफिश में कुशल जीनोम संपादन| journal = Nature Biotechnology | volume = 31 | issue = 3 | pages = 227–229 | date = March 2013 | pmid = 23360964 | pmc = 3686313 | doi = 10.1038/nbt.2501 }}</ref> चूहे<ref name="pmid23643243">{{cite journal | vauthors = Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R | title = One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering | journal = Cell | volume = 153 | issue = 4 | pages = 910–918 | date = May 2013 | pmid = 23643243 | pmc = 3969854 | doi = 10.1016/j.cell.2013.04.025 }}</ref>) आदि.
==ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन==


===दमन===
इस प्रकार से सिंथेटिक एसजीआरएनए को डिजाइन करते समय, केवल 20 एनटी बेस-पेयरिंग अनुक्रम को संशोधित किया जाता है। माध्यमिक वेरिएबल पर भी विचार किया जाना चाहिए: ऑफ-टार्गेट प्रभाव (जिसके लिए बेस-पेयरिंग अनुक्रम का सरल ब्लास्ट रन आवश्यक है), डीसीएएस9-बाइंडिंग हेयरपिन संरचना का रखरखाव, और यह सुनिश्चित करना कि संशोधित एसजीआरएनए में कोई प्रतिबंध साइट उपस्तिथ नहीं है, क्योंकि इससे डाउनस्ट्रीम क्लोनिंग चरणों में समस्या उत्पन्न हो सकती है। जिससे एसजीआरएनए डिज़ाइन की सरलता के कारण, यह तकनीक जीनोम-वाइड स्केलिंग के लिए उत्तरदायी है।<ref name="pmid24136345">{{cite journal | vauthors = Larson MH, Gilbert LA, Wang X, Lim WA, Weissman JS, Qi LS | title = जीन अभिव्यक्ति के अनुक्रम-विशिष्ट नियंत्रण के लिए सीआरआईएसपीआर हस्तक्षेप (सीआरआईएसपीआरआई)।| journal = Nature Protocols | volume = 8 | issue = 11 | pages = 2180–2196 | date = November 2013 | pmid = 24136345 | pmc = 3922765 | doi = 10.1038/nprot.2013.132 }}</ref>  
CRISPRi ट्रांसक्रिप्शनल दीक्षा या बढ़ाव को अवरुद्ध करके [[ प्रतिलेखन (आनुवांशिकी) |प्रतिलेखन (आनुवांशिकी)]] को स्थिर रूप से दबा सकता है। यह [[ प्रवर्तक (आनुवांशिकी) |प्रवर्तक (आनुवांशिकी)]] या एक्सोनिक अनुक्रमों के पूरक एसजीआरएनए को डिजाइन करके पूरा किया जाता है। कोडिंग अनुक्रम के भीतर लक्ष्य के साथ ट्रांसक्रिप्शनल दमन का स्तर स्ट्रैंड-विशिष्ट है।सीआरआईएसपीआर इफ़ेक्टर की प्रकृति के आधार पर, टेम्पलेट या गैर-टेम्पलेट स्ट्रैंड मजबूत दमन की ओर ले जाता है।<ref>{{cite journal | vauthors = Vigouroux A, Bikard D | title = बैक्टीरिया में जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए सीआरआईएसपीआर उपकरण| journal = Microbiology and Molecular Biology Reviews | volume = 84 | issue = 2 | date = May 2020 | pmid = 32238445 | pmc = 7117552 | doi = 10.1128/MMBR.00077-19 }}</ref>


dCas9 (टाइप-2 CRISPR प्रणाली पर आधारित) के लिए, जब गाइड RNA गैर-टेम्पलेट स्ट्रैंड का पूरक होता है तो दमन अधिक मजबूत होता है। यह सुझाव दिया गया है कि यह हेलिकेज़ की गतिविधि के कारण है, जो [[आरएनए पोलीमरेज़ II]] से पहले आरएनए: डीएनए हेटेरोडुप्लेक्स को खोल देता है जब एसजीआरएनए टेम्पलेट स्ट्रैंड का पूरक होता है। ट्रांसक्रिप्शन बढ़ाव ब्लॉक के विपरीत, ट्रांसक्रिप्शनल स्टार्ट साइट को लक्षित करते समय साइलेंसिंग लक्षित डीएनए स्ट्रैंड से स्वतंत्र होती है। प्रोकैरियोट्स में, यह स्थैतिक निषेध लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को लगभग 99.9% तक दबा सकता है; आर्किया में, 90% से अधिक दमन हासिल किया गया था;<ref name="Dhamad_2020">{{cite journal | vauthors = Dhamad AE, Lessner DJ | title = आर्किया के लिए एक CRISPRi-dCas9 प्रणाली और मेथनोसार्सिना एसिटिवोरन्स द्वारा नाइट्रोजन स्थिरीकरण के दौरान जीन फ़ंक्शन की जांच करने के लिए इसका उपयोग| journal = Applied and Environmental Microbiology | volume = 86 | issue = 21 | pages = e01402–20 | date = October 2020 | pmid = 32826220 | pmc = 7580536 | doi = 10.1128/AEM.01402-20 | bibcode = 2020ApEnM..86E1402D | veditors= Atomi H }}</ref> मानव कोशिकाओं में 90% तक दमन देखा गया।<ref name="pmid23452860" /> बैक्टीरिया में, लक्ष्य को पर्याप्त उच्च स्तर के dCas9 कॉम्प्लेक्स से संतृप्त करना संभव है। इस मामले में, दमन शक्ति केवल इस संभावना पर निर्भर करती है कि आरएनए पोलीमरेज़ के साथ टकराव पर dCas9 बाहर निकल जाता है, जो गाइड अनुक्रम द्वारा निर्धारित होता है।<ref name="auto">{{cite journal | vauthors = Vigouroux A, Oldewurtel E, Cui L, Bikard D, van Teeffelen S | title = Tuning dCas9's ability to block transcription enables robust, noiseless knockdown of bacterial genes | journal = Molecular Systems Biology | volume = 14 | issue = 3 | pages = e7899 | date = March 2018 | pmid = 29519933 | pmc = 5842579 | doi = 10.15252/msb.20177899 }}</ref> उच्च तापमान उच्च निष्कासन संभावना से भी जुड़ा होता है, इस प्रकार कमजोर दमन होता है।<ref name="auto" /> यूकेरियोट्स में, CRISPRi प्रभावक डोमेन के माध्यम से प्रतिलेखन को भी दबा सकता है। दमनकारी डोमेन को dCas9 में फ़्यूज़ करने से हेटरोक्रोमैटिनाइज़ेशन को प्रेरित करके प्रतिलेखन को और अधिक दबाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, मानव कोशिकाओं में लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को 99% तक दबाने के लिए अच्छी तरह से अध्ययन किए गए क्रुप्पेल एसोसिएटेड बॉक्स (KRAB) डोमेन को dCas9 से जोड़ा जा सकता है।<ref name="pmid23849981">{{cite journal | vauthors = Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z, Brar GA, Torres SE, Stern-Ginossar N, Brandman O, Whitehead EH, Doudna JA, Lim WA, Weissman JS, Qi LS | display-authors = 6 | title = यूकेरियोट्स में प्रतिलेखन का सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता मॉड्यूलर आरएनए-निर्देशित विनियमन| journal = Cell | volume = 154 | issue = 2 | pages = 442–451 | date = July 2013 | pmid = 23849981 | pmc = 3770145 | doi = 10.1016/j.cell.2013.06.044 }}</ref>
चूंकि सीआरआईएसपीआरआई उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय सीएएस9 की पीढ़ी पर निर्भर करता है। यह जीन एन्कोडिंग सीएएस9 के दो उत्प्रेरक अवशेषों (डी10ए और एच840ए) में बिंदु उत्परिवर्तन प्रारंभ करके पूर्ण किया गया है।<ref name="pmid22745249">{{cite journal | vauthors = Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E | title = अनुकूली जीवाणु प्रतिरक्षा में एक प्रोग्रामयोग्य दोहरे आरएनए-निर्देशित डीएनए एंडोन्यूक्लिज़| journal = Science | volume = 337 | issue = 6096 | pages = 816–821 | date = August 2012 | pmid = 22745249 | pmc = 6286148 | doi = 10.1126/science.1225829 | bibcode = 2012Sci...337..816J }}</ref> ऐसा करने पर, डीसीएएस9 डीएसडीएनए को तोड़ने में असमर्थ है किन्तु डीएनए को लक्षित करने की क्षमता उपस्थित रखता है। अर्थात साथ में, एसजीआरएनए और डीसीएएस9 जीन-विशिष्ट विनियमन के लिए न्यूनतम प्रणाली का निर्माण करते हैं।<ref name="pmid23452860" />  
===दक्षता में सुधार===
==ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन ==
जबकि उत्प्रेरक रूप से सक्रिय Cas9 न्यूक्लियस द्वारा जीनोम-संपादन अपरिवर्तनीय ऑफ-टारगेट जीनोमिक परिवर्तनों के साथ किया जा सकता है, CRISPRi दो अलग-अलग sgRNA अनुक्रमों के लिए न्यूनतम ऑफ-टारगेट प्रतिवर्ती प्रभावों के साथ अत्यधिक विशिष्ट है।<ref name="pmid23849981"/> बहरहाल, ट्रांसक्रिप्शनल मॉड्यूलेशन की दक्षता में सुधार के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन प्रारंभ स्थल की पहचान और एसजीआरएनए की प्राथमिकताओं पर विचार करने से दक्षता में सुधार होता है, जैसा कि लक्ष्य स्थल पर सुलभ [[क्रोमेटिन]] की उपस्थिति से होता है।<ref>{{cite journal | vauthors = Radzisheuskaya A, Shlyueva D, Müller I, Helin K | title = Optimizing sgRNA position markedly improves the efficiency of CRISPR/dCas9-mediated transcriptional repression | journal = Nucleic Acids Research | volume = 44 | issue = 18 | pages = e141 | date = October 2016 | pmid = 27353328 | pmc = 5062975 | doi = 10.1093/nar/gkw583 }}</ref>
====अन्य विधियाँ====
उल्लिखित अन्य #फायदों और सीमाओं के साथ, प्रतिलेखन प्रारंभ से दूरी और स्थानीय क्रोमैटिन स्थिति जैसे कारक सक्रियण/दमन दक्षता निर्धारित करने में महत्वपूर्ण पैरामीटर हो सकते हैं। dCas9 और sgRNA अभिव्यक्ति, स्थिरता, परमाणु स्थानीयकरण और इंटरैक्शन का अनुकूलन संभवतः स्तनधारी कोशिकाओं में CRISPri दक्षता में और सुधार की अनुमति देगा।<ref name="pmid23452860"/>
==अनुप्रयोग==


===जीन नॉकडाउन===
===दमन ===
यूकेरियोट्स में जीनोम (रिपोर्टर और अंतर्जात जीन दोनों) का महत्वपूर्ण हिस्सा आरएनएआई और टेल प्रोटीन जैसी मौजूदा तकनीकों की तुलनीय दक्षता के साथ, dCas9 और sgRNAs को व्यक्त करने के लिए लेंटिवायरल निर्माणों का उपयोग करके लक्षित किया जा सकता है।<ref name="pmid23849981"/> अग्रानुक्रम में या अपनी स्वयं की प्रणाली के रूप में, CRISPRi का उपयोग RNAi के समान RNA हस्तक्षेप#अनुप्रयोग प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है।
इस प्रकार से सीआरआईएसपीआरआई ट्रांसक्रिप्शनल दीक्षा या बढ़ाव को अवरुद्ध करके [[ प्रतिलेखन (आनुवांशिकी) |प्रतिलेखन (आनुवांशिकी)]] को स्थिर रूप से दबा सकता है। यह [[ प्रवर्तक (आनुवांशिकी) |प्रवर्तक (आनुवांशिकी)]] या एक्सोनिक अनुक्रमों के पूरक एसजीआरएनए को डिजाइन करके पूर्ण किया जाता है। और कोडिंग अनुक्रम के अन्दर लक्ष्य के साथ ट्रांसक्रिप्शनल दमन का स्तर स्ट्रैंड-विशिष्ट है।सीआरआईएसपीआर इफ़ेक्टर की प्रकृति के आधार पर, टेम्पलेट या गैर-टेम्पलेट स्ट्रैंड सशक्त दमन की ओर ले जाता है।<ref>{{cite journal | vauthors = Vigouroux A, Bikard D | title = बैक्टीरिया में जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए सीआरआईएसपीआर उपकरण| journal = Microbiology and Molecular Biology Reviews | volume = 84 | issue = 2 | date = May 2020 | pmid = 32238445 | pmc = 7117552 | doi = 10.1128/MMBR.00077-19 }}</ref>


बैक्टीरिया के लिए, CRISPRi द्वारा जीन नॉकडाउन को पूरी तरह से कार्यान्वित किया गया है और ग्राम-नेगेटिव ई. कोलाई दोनों के लिए (ऑफ-टार्गेट विश्लेषण, लीकी दमन) की विशेषता बताई गई है। <ref name="pmid23360965" /><ref name="pmid27996021" /> और ग्राम-पॉजिटिव बी. सबटिलिस।<ref name="pmid27238023" />
जिससे डीसीएएस9 (टाइप-2 सीआरआईएसपीआर प्रणाली पर आधारित) के लिए, जब गाइड आरएनए गैर-टेम्पलेट स्ट्रैंड का पूरक होता है। तब दमन अधिक सशक्त होता है। यह सुझाव दिया गया है कि यह हेलिकेज़ की गतिविधि के कारण है, जो [[आरएनए पोलीमरेज़ II]] से पहले आरएनए: डीएनए हेटेरोडुप्लेक्स को खोल देता है जब एसजीआरएनए टेम्पलेट स्ट्रैंड का पूरक होता है। तब ट्रांसक्रिप्शन बढ़ाव ब्लॉक के विपरीत, ट्रांसक्रिप्शनल स्टार्ट साइट को लक्षित करते समय साइलेंसिंग लक्षित डीएनए स्ट्रैंड से स्वतंत्र होती है। और प्रोकैरियोट्स में, यह स्थैतिक निषेध लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को लगभग 99.9% तक दबा सकता है; आर्किया में, 90% से अधिक दमन प्राप्त किया गया था;<ref name="Dhamad_2020">{{cite journal | vauthors = Dhamad AE, Lessner DJ | title = आर्किया के लिए एक CRISPRi-dCas9 प्रणाली और मेथनोसार्सिना एसिटिवोरन्स द्वारा नाइट्रोजन स्थिरीकरण के दौरान जीन फ़ंक्शन की जांच करने के लिए इसका उपयोग| journal = Applied and Environmental Microbiology | volume = 86 | issue = 21 | pages = e01402–20 | date = October 2020 | pmid = 32826220 | pmc = 7580536 | doi = 10.1128/AEM.01402-20 | bibcode = 2020ApEnM..86E1402D | veditors= Atomi H }}</ref> इस प्रकार से मानव कोशिकाओं में 90% तक दमन देखा गया है।<ref name="pmid23452860" /> किन्तु बैक्टीरिया में, लक्ष्य को पर्याप्त उच्च स्तर के डीसीएएस9 कॉम्प्लेक्स से संतृप्त करना संभव है। इस स्तिथि में, दमन शक्ति केवल इस संभावना पर निर्भर करती है, कि आरएनए पोलीमरेज़ के साथ टकराव पर डीसीएएस9 बाहर निकल जाता है, जो की गाइड अनुक्रम द्वारा निर्धारित होता है।<ref name="auto">{{cite journal | vauthors = Vigouroux A, Oldewurtel E, Cui L, Bikard D, van Teeffelen S | title = Tuning dCas9's ability to block transcription enables robust, noiseless knockdown of bacterial genes | journal = Molecular Systems Biology | volume = 14 | issue = 3 | pages = e7899 | date = March 2018 | pmid = 29519933 | pmc = 5842579 | doi = 10.15252/msb.20177899 }}</ref> अतः उच्च तापमान उच्च निष्कासन संभावना से भी जुड़ा होता है, इस प्रकार नीर्बल का दमन होता है।<ref name="auto" /> यूकेरियोट्स में, सीआरआईएसपीआरआई प्रभावक डोमेन के माध्यम से प्रतिलेखन को भी दबा सकता है। दमनकारी डोमेन को डीसीएएस9 में फ़्यूज़ करने से हेटरोक्रोमैटिनाइज़ेशन को प्रेरित करके प्रतिलेखन को और अधिक दबाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, मानव कोशिकाओं में लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को 99% तक दबाने के लिए अच्छी तरह से अध्ययन किए गए क्रुप्पेल एसोसिएटेड बॉक्स (केआरएबी ) डोमेन को डीसीएएस9 से जोड़ा जा सकता है।<ref name="pmid23849981">{{cite journal | vauthors = Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z, Brar GA, Torres SE, Stern-Ginossar N, Brandman O, Whitehead EH, Doudna JA, Lim WA, Weissman JS, Qi LS | display-authors = 6 | title = यूकेरियोट्स में प्रतिलेखन का सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता मॉड्यूलर आरएनए-निर्देशित विनियमन| journal = Cell | volume = 154 | issue = 2 | pages = 442–451 | date = July 2013 | pmid = 23849981 | pmc = 3770145 | doi = 10.1016/j.cell.2013.06.044 }}</ref>
न केवल बैक्टीरिया में बल्कि आर्किया (उदाहरण के लिए, एम. एसिटिवोरन्स) में भी CRISPRi-Cas9 का उपयोग नाइट्रोजन स्थिरीकरण से संबंधित कई जीन/ऑपेरॉन को नष्ट करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया था।<ref name = "Dhamad_2020" />
===दक्षता में सुधार ===
जबकि उत्प्रेरक रूप से सक्रिय सीएएस9 न्यूक्लियस द्वारा जीनोम-संपादन अपरिवर्तनीय ऑफ-टारगेट जीनोमिक परिवर्तनों के साथ किया जा सकता है, सीआरआईएसपीआरआई दो भिन्न-भिन्न एसजीआरएनए अनुक्रमों के लिए न्यूनतम ऑफ-टारगेट प्रतिवर्ती प्रभावों के साथ अत्यधिक विशिष्ट है।<ref name="pmid23849981"/> प्रत्येक, ट्रांसक्रिप्शनल मॉड्यूलेशन की दक्षता में सुधार के लिए अनेक विधि विकसित कि गई हैं। और लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन प्रारंभ स्थल की पहचान और एसजीआरएनए की प्राथमिकताओं पर विचार करने से दक्षता में सुधार होता है, जैसा कि लक्ष्य स्थल पर सुलभ [[क्रोमेटिन|क्रोमैटिन]] की उपस्थिति से होता है।<ref>{{cite journal | vauthors = Radzisheuskaya A, Shlyueva D, Müller I, Helin K | title = Optimizing sgRNA position markedly improves the efficiency of CRISPR/dCas9-mediated transcriptional repression | journal = Nucleic Acids Research | volume = 44 | issue = 18 | pages = e141 | date = October 2016 | pmid = 27353328 | pmc = 5062975 | doi = 10.1093/nar/gkw583 }}</ref>
====अन्य विधियाँ ====
उल्लिखित अन्य लाभ और सीमाओं के साथ, प्रतिलेखन प्रारंभ से दूरी और स्थानीय क्रोमैटिन स्थिति जैसे कारक सक्रियण/दमन दक्षता निर्धारित करने में महत्वपूर्ण पैरामीटर हो सकते हैं। जिससे डीसीएएस9 और एसजीआरएनए अभिव्यक्ति, स्थिरता, परमाणु स्थानीयकरण और इंटरैक्शन का अनुकूलन संभवतः स्तनधारी कोशिकाओं में सीआरआईएसपीआरआई दक्षता में और सुधार की अनुमति से होता है।<ref name="pmid23452860"/>  
==अनुप्रयोग ==


फ़ाइल:CRISPRflowchart.pdf|अंगूठा
===जीन नॉकडाउन ===
यूकेरियोट्स में जीनोम (रिपोर्टर और अंतर्जात जीन दोनों) का महत्वपूर्ण भाग आरएनएआई और टेल प्रोटीन जैसी उपस्तिथ तकनीकों की तुलनीय दक्षता के साथ, डीसीएएस9 और एसजीआरएनए को व्यक्त करने के लिए लेंटिवायरल निर्माणों का उपयोग करके लक्षित किया जा सकता है।<ref name="pmid23849981"/> और अग्रानुक्रम में या अपनी स्वयं की प्रणाली के रूप में, सीआरआईएसपीआरआई का उपयोग आरएनएआई के समान आरएनए व्यतिकरण या अनुप्रयोग प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है।


===एलिलिक श्रृंखला===
इस प्रकार से बैक्टीरिया के लिए, सीआरआईएसपीआरआई द्वारा जीन नॉकडाउन को पूर्ण रूप से कार्यान्वित किया गया है और ग्राम-नेगेटिव E. कोली और ग्राम-पॉजिटिव बी. सबटिलिस दोनों के लिए (ऑफ-टार्गेट विश्लेषण, लीकी दमन) की विशेषता बताई गई है। <ref name="pmid23360965" /><ref name="pmid27996021" /><ref name="pmid27238023" />
लक्ष्य लोकी में एसजीआरएनए बेस-पेयरिंग की दक्षता को संशोधित करके विभेदक जीन अभिव्यक्ति प्राप्त की जा सकती है।<ref name="pmid24136345"/> सिद्धांत रूप में, इस दक्षता को संशोधित करके किसी भी जीन के लिए एलीलिक श्रृंखला बनाने के लिए उपयोग किया जा सकता है, संक्षेप में हाइपो- और हाइपरमोर्फ का संग्रह तैयार किया जा सकता है। इन शक्तिशाली संग्रहों का उपयोग किसी भी आनुवंशिक जांच की जांच के लिए किया जा सकता है। मुलर के मॉर्फ के लिए, यह जीन नॉकआउट की द्विआधारी प्रकृति और नॉकडाउन की अप्रत्याशितता के विपरीत जीन फ़ंक्शन की वृद्धिशील कमी की अनुमति देता है। मुलर के मॉर्फ के लिए, यह चर शक्ति वाले प्रमोटरों के तहत रुचि के जीन की क्लोनिंग की पारंपरिक विधि के विपरीत है।


===जीनोम लोकी इमेजिंग===
जिसमे न केवल बैक्टीरिया में किन्तु आर्किया (उदाहरण के लिए, M. एसिटिवोरन्स) में भी सीआरआईएसपीआरआई-सीएएस9 का उपयोग नाइट्रोजन स्थिरीकरण से संबंधित अनेक जीन/ऑपेरॉन को नष्ट करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया था।<ref name="Dhamad_2020" />
[[हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन]] को dCas9 में मिलाने से जीवित मानव कोशिकाओं में जीनोमिक लोकी की इमेजिंग की अनुमति मिलती है।<ref name="pmid24360272">{{cite journal | vauthors = Chen B, Gilbert LA, Cimini BA, Schnitzbauer J, Zhang W, Li GW, Park J, Blackburn EH, Weissman JS, Qi LS, Huang B | display-authors = 6 | title = Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system | journal = Cell | volume = 155 | issue = 7 | pages = 1479–1491 | date = December 2013 | pmid = 24360272 | pmc = 3918502 | doi = 10.1016/j.cell.2013.12.001 }}</ref> स्वस्थानी संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति की तुलना में, विधि विशिष्ट रूप से गुणसूत्र लोकी की गतिशील ट्रैकिंग की अनुमति देती है। इसका उपयोग हेला कोशिकाओं सहित प्रयोगशाला सेल लाइनों में क्रोमैटिन वास्तुकला और परमाणु संगठन की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए किया गया है।


===स्टेम कोशिकाएँ===
===एलिलिक श्रृंखला ===
सीआरआईएसपीआरए द्वारा रि[[प्रोग्रामिंग]] के सक्रियण का उपयोग मानव और माउस कोशिकाओं [[प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल]] को प्रेरित करने के लिए किया गया है जो आईपीएस प्रौद्योगिकी के लिए वैकल्पिक विधि प्रदान करता है।<ref name="pmid24346702">{{cite journal | vauthors = Kearns NA, Genga RM, Enuameh MS, Garber M, Wolfe SA, Maehr R | title = Cas9 effector-mediated regulation of transcription and differentiation in human pluripotent stem cells | journal = Development | volume = 141 | issue = 1 | pages = 219–223 | date = January 2014 | pmid = 24346702 | pmc = 3865759 | doi = 10.1242/dev.103341 }}</ref><ref name="pmid24500196">{{cite journal | vauthors = Hu J, Lei Y, Wong WK, Liu S, Lee KC, He X, You W, Zhou R, Guo JT, Chen X, Peng X, Sun H, Huang H, Zhao H, Feng B | display-authors = 6 | title = Direct activation of human and mouse Oct4 genes using engineered TALE and Cas9 transcription factors | journal = Nucleic Acids Research | volume = 42 | issue = 7 | pages = 4375–4390 | date = April 2014 | pmid = 24500196 | pmc = 3985678 | doi = 10.1093/nar/gku109 }}</ref> इसके अलावा, बड़े पैमाने पर सक्रियण स्क्रीन का उपयोग उन प्रोटीनों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो प्रेरित प्लुरिपोटेंसी को बढ़ावा देते हैं या, इसके विपरीत, भेदभाव को बढ़ावा देते हैं
लक्ष्य लोकी में एसजीआरएनए बेस-पेयरिंग की दक्षता को संशोधित करके विभेदक जीन अभिव्यक्ति प्राप्त की जा सकती है।<ref name="pmid24136345"/> सिद्धांत रूप में, इस दक्षता को संशोधित करके किसी भी जीन के लिए एलीलिक श्रृंखला बनाने के लिए उपयोग किया जा सकता है, और संक्षेप में हाइपो- और हाइपरमोर्फ का संग्रह तैयार किया जा सकता है। इन शक्तिशाली संग्रहों का उपयोग किसी भी आनुवंशिक जांच की जांच के लिए किया जा सकता है। अतः मुलर के मॉर्फ के लिए, यह जीन नॉकआउट की द्विआधारी प्रकृति और नॉकडाउन की अप्रत्याशितता के विपरीत जीन फ़ंक्शन की वृद्धिशील कमी की अनुमति देता है। जिससे मुलर के मॉर्फ के लिए, यह वेरिएबल शक्ति वाले प्रमोटरों के अधीन रुचि के जीन की क्लोनिंग की पारंपरिक विधि के विपरीत है।
एक विशिष्ट कोशिका वंश के लिए।<ref name="pmid16904174">{{cite journal | vauthors = Takahashi K, Yamanaka S | title = परिभाषित कारकों द्वारा माउस भ्रूण और वयस्क फ़ाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों से प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का प्रेरण| journal = Cell | volume = 126 | issue = 4 | pages = 663–676 | date = August 2006 | pmid = 16904174 | doi = 10.1016/j.cell.2006.07.024 | hdl-access = free | author-link2 = Shinya Yamanaka | s2cid = 1565219 | hdl = 2433/159777 }}</ref>
 
===जेनेटिक स्क्रीनिंग===
===जीनोम लोकी इमेजिंग ===
एकल sgRNA के साथ dCas9-SunTag का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति को अपग्रेड करने की क्षमता बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन, जैसे कि [[पर्टर्ब-सीक]], के द्वार भी खोलती है, जिससे जीन अभिव्यक्ति में वृद्धि या कमी के परिणामस्वरूप होने वाले फेनोटाइप को उजागर किया जा सके, जो समझने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण होगा। कैंसर में जीन विनियमन का प्रभाव.<ref name="pmid25307933">{{cite journal | vauthors = Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, Vale RD | title = जीन अभिव्यक्ति और प्रतिदीप्ति इमेजिंग में सिग्नल प्रवर्धन के लिए एक प्रोटीन-टैगिंग प्रणाली| journal = Cell | volume = 159 | issue = 3 | pages = 635–646 | date = October 2014 | pmid = 25307933 | pmc = 4252608 | doi = 10.1016/j.cell.2014.09.039 }}</ref> इसके अलावा, CRISPRi सिस्टम को [[क्षैतिज जीन स्थानांतरण]] तंत्र जैसे [[जीवाणु संयुग्मन]] और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में रिपोर्टर जीन के विशिष्ट दमन के माध्यम से हस्तांतरणीय दिखाया गया है। CRISPRi आनुवंशिक जांच और संभावित जीवाणु जनसंख्या नियंत्रण के लिए उपकरण के रूप में काम कर सकता है।<ref name="pmid25409531">{{cite journal | vauthors = Ji W, Lee D, Wong E, Dadlani P, Dinh D, Huang V, Kearns K, Teng S, Chen S, Haliburton J, Heimberg G, Heineike B, Ramasubramanian A, Stevens T, Helmke KJ, Zepeda V, Qi LS, Lim WA | display-authors = 6 | title = CRISPri प्रणाली द्वारा विशिष्ट जीन दमन को जीवाणु संयुग्मन के माध्यम से स्थानांतरित किया जाता है| journal = ACS Synthetic Biology | volume = 3 | issue = 12 | pages = 929–931 | date = December 2014 | pmid = 25409531 | pmc = 4277763 | doi = 10.1021/sb500036q }}</ref>
[[हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन|फ्लोरोसेंट प्रोटीन]] को डीसीएएस9 में मिलाने से जीवित मानव कोशिकाओं में जीनोमिक लोकी की इमेजिंग की अनुमति मिलती है।<ref name="pmid24360272">{{cite journal | vauthors = Chen B, Gilbert LA, Cimini BA, Schnitzbauer J, Zhang W, Li GW, Park J, Blackburn EH, Weissman JS, Qi LS, Huang B | display-authors = 6 | title = Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system | journal = Cell | volume = 155 | issue = 7 | pages = 1479–1491 | date = December 2013 | pmid = 24360272 | pmc = 3918502 | doi = 10.1016/j.cell.2013.12.001 }}</ref> जिससे स्वस्थानी संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति की तुलना में, विधि विशिष्ट रूप से गुणसूत्र लोकी की गतिशील ट्रैकिंग की अनुमति देती है। इसका उपयोग हेला कोशिकाओं सहित प्रयोगशाला कोशिकाएँ लाइनों में क्रोमैटिन वास्तुकला और परमाणु संगठन की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए किया गया है।
==फायदे और सीमाएँ==
 
===स्टेम कोशिकाएँ ===
सीआरआईएसपीआरए द्वारा रि[[प्रोग्रामिंग]] के सक्रियण का उपयोग मानव और माउस कोशिकाओं [[प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल|प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाएँ]] को प्रेरित करने के लिए किया गया है जो की आईपीएस प्रौद्योगिकी के लिए वैकल्पिक विधि प्रदान करता है।<ref name="pmid24346702">{{cite journal | vauthors = Kearns NA, Genga RM, Enuameh MS, Garber M, Wolfe SA, Maehr R | title = Cas9 effector-mediated regulation of transcription and differentiation in human pluripotent stem cells | journal = Development | volume = 141 | issue = 1 | pages = 219–223 | date = January 2014 | pmid = 24346702 | pmc = 3865759 | doi = 10.1242/dev.103341 }}</ref><ref name="pmid24500196">{{cite journal | vauthors = Hu J, Lei Y, Wong WK, Liu S, Lee KC, He X, You W, Zhou R, Guo JT, Chen X, Peng X, Sun H, Huang H, Zhao H, Feng B | display-authors = 6 | title = Direct activation of human and mouse Oct4 genes using engineered TALE and Cas9 transcription factors | journal = Nucleic Acids Research | volume = 42 | issue = 7 | pages = 4375–4390 | date = April 2014 | pmid = 24500196 | pmc = 3985678 | doi = 10.1093/nar/gku109 }}</ref> इसके अतिरिक्त, उच्च माप पर सक्रियण स्क्रीन का उपयोग उन प्रोटीनों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो की प्रेरित प्लुरिपोटेंसी को बढ़ावा देते हैं या, इसके विपरीत, एक विशिष्ट कोशिका वंश के लिए भेदभाव को बढ़ावा देते हैं।<ref name="pmid16904174">{{cite journal | vauthors = Takahashi K, Yamanaka S | title = परिभाषित कारकों द्वारा माउस भ्रूण और वयस्क फ़ाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों से प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का प्रेरण| journal = Cell | volume = 126 | issue = 4 | pages = 663–676 | date = August 2006 | pmid = 16904174 | doi = 10.1016/j.cell.2006.07.024 | hdl-access = free | author-link2 = Shinya Yamanaka | s2cid = 1565219 | hdl = 2433/159777 }}</ref>  
===जेनेटिक स्क्रीनिंग ===
एकल एसजीआरएनए के साथ डीसीएएस9-सनटैग का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति को अपग्रेड करने की क्षमता उच्च माप पर आनुवंशिक स्क्रीन है, जैसे कि [[पर्टर्ब-सीक]], के द्वार भी खोलती है, जिससे जीन अभिव्यक्ति में वृद्धि या कमी के परिणामस्वरूप होने वाले फेनोटाइप को उजागर किया जा सकता है, जो की समझने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण होता है। और कैंसर में जीन विनियमन का प्रभाव है।<ref name="pmid25307933">{{cite journal | vauthors = Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, Vale RD | title = जीन अभिव्यक्ति और प्रतिदीप्ति इमेजिंग में सिग्नल प्रवर्धन के लिए एक प्रोटीन-टैगिंग प्रणाली| journal = Cell | volume = 159 | issue = 3 | pages = 635–646 | date = October 2014 | pmid = 25307933 | pmc = 4252608 | doi = 10.1016/j.cell.2014.09.039 }}</ref> इसके अतिरिक्त, सीआरआईएसपीआरआई प्रणाली को [[क्षैतिज जीन स्थानांतरण]] तंत्र जैसे [[जीवाणु संयुग्मन]] और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में रिपोर्टर जीन के विशिष्ट दमन के माध्यम से हस्तांतरणीय दिखाया गया है। अतः सीआरआईएसपीआरआई आनुवंशिक जांच और संभावित जीवाणु जनसंख्या नियंत्रण के लिए उपकरण के रूप में कार्य कर सकता है।<ref name="pmid25409531">{{cite journal | vauthors = Ji W, Lee D, Wong E, Dadlani P, Dinh D, Huang V, Kearns K, Teng S, Chen S, Haliburton J, Heimberg G, Heineike B, Ramasubramanian A, Stevens T, Helmke KJ, Zepeda V, Qi LS, Lim WA | display-authors = 6 | title = CRISPri प्रणाली द्वारा विशिष्ट जीन दमन को जीवाणु संयुग्मन के माध्यम से स्थानांतरित किया जाता है| journal = ACS Synthetic Biology | volume = 3 | issue = 12 | pages = 929–931 | date = December 2014 | pmid = 25409531 | pmc = 4277763 | doi = 10.1021/sb500036q }}</ref>  
==लाभ और सीमाएँ ==
 
===लाभ ===
#सीआरआईएसपीआरआई हित के लक्ष्य जीन को 99.9% दमन तक शांत कर सकता है।<ref name="pmid24136345"/> और दमन की शक्ति को गाइड आरएनए और लक्ष्य के मध्य पूरकता की मात्रा को परिवर्तन करके समायोजित किया जा सकता है। प्रेरक प्रवर्तकों के विपरीत, सीआरआईएसपीआरआई द्वारा आंशिक दमन लक्ष्य की अभिव्यक्ति में [[ट्रांसक्रिप्शनल शोर|ट्रांसक्रिप्शनल ध्वनि]] नहीं जोड़ता है।<ref name="auto"/> चूंकि दमन का स्तर डीएनए अनुक्रम में एन्कोड किया गया है, इसलिए विभिन्न अभिव्यक्ति स्तरों को प्रतिस्पर्धा में विकसित किया जा सकता है और अनुक्रमण द्वारा पहचाना जा सकता है।<ref>{{Cite journal| doi = 10.1101/805333| pages = 805333| vauthors = Hawkins JS, Silvis MR, Koo BM, Peters JM, Jost M, Hearne CC, Weissman JS, Todor H, Gross CA | display-authors = 6 | title = संग्राहक प्रभावकारिता CRISPRi बैक्टीरिया में आवश्यक जीन अभिव्यक्ति-फिटनेस संबंधों के विकासवादी संरक्षण का खुलासा करती है| journal = bioRxiv| access-date = 2020-01-16| date = 2019-10-15| s2cid = 208583386| url = https://www.biorxiv.org/content/10.1101/805333v1| doi-access = free}}</ref>
#चूंकि सीआरआईएसपीआरआई एसजीआरएनए-डीएनए के वॉटसन-क्रिक बेस-पेयरिंग और एनजीजी पीएएम मोटिफ पर आधारित है, इसलिए जीनोम के अन्दर लक्षित साइटों का चयन सीधा और लचीला है। सावधानीपूर्वक परिभाषित प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं।<ref name="pmid24136345"/>
#जिससे एकाधिक एसजीआरएनएस का उपयोग न केवल साथ अनेक भिन्न-भिन्न जीनों को नियंत्रित करने के लिए (मल्टीप्लेक्स सीआरआईएसपीआरआई ) किया जा सकता है, किन्तु जीन लक्ष्य को विनियमित करने की दक्षता को बढ़ाने के लिए भी किया जा सकता है। और अनेक एसजीआरएनए को साथ व्यक्त करने की लोकप्रिय रणनीति एसजीआरएनए को अनेक प्रमोटरों या प्रसंस्करण तत्वों के साथ ही निर्माण में व्यवस्थित करना है। इस प्रकार से उदाहरण के लिए, एक्स्ट्रा-लॉन्ग एसजीआरएनए एरेज़ (ईएलएसए) जीन संश्लेषण प्रदाता से 12-एसजीआरएनए एरेज़ के सीधे संश्लेषण की अनुमति देने के लिए गैर-दोहराव वाले भागों का उपयोग करते हैं, इसे सीधे E. कोली जीनोम में समरूप पुनर्संयोजन के बिना एकीकृत किया जा सकता है, और सम्मिश्र फेनोटाइप प्राप्त करने के लिए अनेक जीनों को लक्षित कर सकते हैं।<ref>{{cite journal | vauthors = Reis AC, Halper SM, Vezeau GE, Cetnar DP, Hossain A, Clauer PR, Salis HM | title = गैर-दोहरावीय अतिरिक्त-लंबे एसजीआरएनए सरणियों का उपयोग करके कई जीवाणु जीनों का एक साथ दमन| journal = Nature Biotechnology | volume = 37 | issue = 11 | pages = 1294–1301 | date = November 2019 | pmid = 31591552 | doi = 10.1038/s41587-019-0286-9 | osti = 1569832 | s2cid = 203852115 }}</ref>
#चूंकि दोनों प्रणालियाँ पूरक हो सकती हैं, सीआरआईएसपीआरआई आरएनएआई की तुलना में लाभ प्रदान करता है। बहिर्जात प्रणाली के रूप में, सीआरआईएसपीआरआई माइक्रो आरएनए अभिव्यक्ति या फ़ंक्शन जैसी अंतर्जात मशीनरी के साथ प्रतिस्पर्धा नहीं करता है। इसके अतिरिक्त, क्योंकि सीआरआईएसपीआरआई डीएनए स्तर पर कार्य करता है, कोई गैर-कोडिंग आरएनए, माइक्रोआरएनए, एंटीसेंस ट्रांसक्रिप्ट, परमाणु-स्थानीयकृत आरएनए और पोलीमरेज़ III ट्रांसक्रिप्ट जैसे ट्रांसक्रिप्ट को लक्षित कर सकता है। अंत में, सीआरआईएसपीआरआई के पास अधिक उच्च लक्षित अनुक्रम स्थान है; प्रमोटरों और, सिद्धांत रूप में, इंट्रोन्स को भी लक्षित किया जा सकता है।<ref name="pmid23849981" />
#E. कोली में, जीन नॉकडाउन स्ट्रेन का निर्माण अधिक तीव्र होता है और इसके लिए केवल एक-चरणीय ओलिगो [[पुनर्संयोजन]] की आवश्यकता होती है।<ref name="pmid27996021" />
===सीमाएँ ===
#प्रोटोस्पेसर आसन्न रूपांकन (पीएएम) अनुक्रम की आवश्यकता संभावित लक्ष्य अनुक्रमों की संख्या को सीमित करती है। अतः सीएएस9 और इसके होमोलॉग विभिन्न पीएएम अनुक्रमों का उपयोग कर सकते हैं, और इसलिए संभावित लक्ष्य अनुक्रमों की संख्या का विस्तार करने के लिए सैद्धांतिक रूप से इसका उपयोग किया जा सकता है।<ref name="pmid24136345"/>
#लक्ष्य लोकी की अनुक्रम विशिष्टता केवल 14 एनटी लंबी (एसजीआरएनए की 12एनटी और पीएएम की 2एनटी) है, जो मानव जीनोम में लगभग 11 बार पुनरावृत्ति कर सकती है।<ref name="pmid24136345" /> जिससे प्रतिलेखन प्रारंभ स्थल से लक्ष्य स्थल की दूरी के साथ दमन का विपरीत संबंध है। अर्थात जीनोम-व्यापी कम्प्यूटेशनल पूर्वानुमान या लंबे पीएएम के साथ सीएएस9 होमोलॉग का चयन गैर-विशिष्ट लक्ष्यीकरण को कम कर सकता है।
#अंतर्जात क्रोमैटिन अवस्थाएं और संशोधन डीसीएएस9-एसजीआरएनए कॉम्प्लेक्स के अनुक्रम-विशिष्ट बंधन को रोक सकते हैं।<ref name="pmid24136345" /> और स्तनधारी कोशिकाओं में ट्रांसक्रिप्शनल दमन का स्तर जीन के मध्य भिन्न होता है। किन्तु बाइंडिंग और नियामक दक्षता के संबंध में स्थानीय डीएनए संरचना और क्रोमैटिन की भूमिका को समझने के लिए अधिक कार्य करने की आवश्यकता है।
#सीआरआईएसपीआरआई उन जीनों को प्रभावित कर सकता है जो की लक्ष्य जीन के समीप हैं। और यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब उन जीनों को लक्षित किया जाता है या तो अन्य जीनों (सेंस या एंटीसेंस ओवरलैपिंग) को ओवरलैप करते हैं या द्विदिश प्रमोटर द्वारा संचालित होते हैं।<ref>{{cite journal | vauthors = Goyal A, Myacheva K, Groß M, Klingenberg M, Duran Arqué B, Diederichs S | title = Challenges of CRISPR/Cas9 applications for long non-coding RNA genes | journal = Nucleic Acids Research | volume = 45 | issue = 3 | pages = e12 | date = February 2017 | pmid = 28180319 | pmc = 5388423 | doi = 10.1093/nar/gkw883 }}</ref>
#यूकेरियोट्स में अनुक्रम-विशिष्ट विषाक्तता की सूचना मिली है, कि पीएएम-समीपस्थ क्षेत्र में कुछ अनुक्रमों के कारण उच्च फिटनेस भार उत्पन्न हो रहा है।<ref>{{cite journal | vauthors = Cui L, Vigouroux A, Rousset F, Varet H, Khanna V, Bikard D | title = A CRISPRi screen in E. coli reveals sequence-specific toxicity of dCas9 | journal = Nature Communications | volume = 9 | issue = 1 | pages = 1912 | date = May 2018 | pmid = 29765036 | pmc = 5954155 | doi = 10.1038/s41467-018-04209-5 | bibcode = 2018NatCo...9.1912C }}</ref> यह घटना, जिसे "बीज का बुरा प्रभाव" कहा जाता है।<ref>{{cite journal | vauthors = Depardieu F, Bikard D | title = Gene silencing with CRISPRi in bacteria and optimization of dCas9 expression levels | journal = Methods | volume = 172 | pages = 61–75 | date = February 2020 | pmid = 31377338 | doi = 10.1016/j.ymeth.2019.07.024 | series = Methods for characterizing, applying, and teaching CRISPR-Cas systems | s2cid = 199436713 | url = https://hal-pasteur.archives-ouvertes.fr/pasteur-02476079/file/Depardieu_Bikard_2020_Gene_silencing.pdf }}</ref> अभी भी अस्पष्ट है किन्तु डीसीएएस9 के अभिव्यक्ति स्तर को अनुकूलित करके इसे कम किया जा सकता है।


===फायदे===
#CRISPRi हित के लक्ष्य जीन को 99.9% दमन तक शांत कर सकता है।<ref name="pmid24136345"/> दमन की ताकत को गाइड आरएनए और लक्ष्य के बीच पूरकता की मात्रा को बदलकर भी समायोजित किया जा सकता है। प्रेरक प्रवर्तकों के विपरीत, CRISPRi द्वारा आंशिक दमन लक्ष्य की अभिव्यक्ति में [[ट्रांसक्रिप्शनल शोर]] नहीं जोड़ता है।<ref name="auto"/> चूंकि दमन का स्तर डीएनए अनुक्रम में एन्कोड किया गया है, इसलिए विभिन्न अभिव्यक्ति स्तरों को प्रतिस्पर्धा में विकसित किया जा सकता है और अनुक्रमण द्वारा पहचाना जा सकता है।<ref>{{Cite journal| doi = 10.1101/805333| pages = 805333| vauthors = Hawkins JS, Silvis MR, Koo BM, Peters JM, Jost M, Hearne CC, Weissman JS, Todor H, Gross CA | display-authors = 6 | title = संग्राहक प्रभावकारिता CRISPRi बैक्टीरिया में आवश्यक जीन अभिव्यक्ति-फिटनेस संबंधों के विकासवादी संरक्षण का खुलासा करती है| journal = bioRxiv| access-date = 2020-01-16| date = 2019-10-15| s2cid = 208583386| url = https://www.biorxiv.org/content/10.1101/805333v1| doi-access = free}}</ref>
#चूंकि CRISPRi sgRNA-DNA के वॉटसन-क्रिक बेस-पेयरिंग और NGG PAM मोटिफ पर आधारित है, इसलिए जीनोम के भीतर लक्षित साइटों का चयन सीधा और लचीला है। सावधानीपूर्वक परिभाषित प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं।<ref name="pmid24136345"/> #एकाधिक sgRNAs का उपयोग न केवल साथ कई अलग-अलग जीनों को नियंत्रित करने के लिए किया जा सकता है (मल्टीप्लेक्स CRISPRi), बल्कि ही जीन लक्ष्य को विनियमित करने की दक्षता को बढ़ाने के लिए भी किया जा सकता है। कई एसजीआरएनए को साथ व्यक्त करने की लोकप्रिय रणनीति एसजीआरएनए को कई प्रमोटरों या प्रसंस्करण तत्वों के साथ ही निर्माण में व्यवस्थित करना है। उदाहरण के लिए, एक्स्ट्रा-लॉन्ग एसजीआरएनए एरेज़ (ईएलएसए) जीन संश्लेषण प्रदाता से 12-एसजीआरएनए एरेज़ के सीधे संश्लेषण की अनुमति देने के लिए गैर-दोहराव वाले भागों का उपयोग करते हैं, इसे सीधे ई. कोली जीनोम में समरूप पुनर्संयोजन के बिना एकीकृत किया जा सकता है, और साथ कई जीनों को लक्षित कर सकते हैं। जटिल फेनोटाइप प्राप्त करने के लिए।<ref>{{cite journal | vauthors = Reis AC, Halper SM, Vezeau GE, Cetnar DP, Hossain A, Clauer PR, Salis HM | title = गैर-दोहरावीय अतिरिक्त-लंबे एसजीआरएनए सरणियों का उपयोग करके कई जीवाणु जीनों का एक साथ दमन| journal = Nature Biotechnology | volume = 37 | issue = 11 | pages = 1294–1301 | date = November 2019 | pmid = 31591552 | doi = 10.1038/s41587-019-0286-9 | osti = 1569832 | s2cid = 203852115 }}</ref>
#हालाँकि दोनों प्रणालियाँ पूरक हो सकती हैं, CRISPRi RNAi की तुलना में लाभ प्रदान करता है। बहिर्जात प्रणाली के रूप में, CRISPRi माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति या फ़ंक्शन जैसी अंतर्जात मशीनरी के साथ प्रतिस्पर्धा नहीं करता है। इसके अलावा, क्योंकि CRISPRi डीएनए स्तर पर कार्य करता है, कोई गैर-कोडिंग आरएनए, माइक्रोआरएनए, एंटीसेंस ट्रांसक्रिप्ट, परमाणु-स्थानीयकृत आरएनए और पोलीमरेज़ III ट्रांसक्रिप्ट जैसे ट्रांसक्रिप्ट को लक्षित कर सकता है। अंत में, CRISPRi के पास बहुत बड़ा लक्षित अनुक्रम स्थान है; प्रमोटरों और, सिद्धांत रूप में, इंट्रोन्स को भी लक्षित किया जा सकता है।<ref name="pmid23849981"/> #ई. कोली में, जीन नॉकडाउन स्ट्रेन का निर्माण बेहद तेज़ होता है और इसके लिए केवल एक-चरणीय ओलिगो [[पुनर्संयोजन]] की आवश्यकता होती है।<ref name="pmid27996021"/>
===सीमाएँ===
#प्रोटोस्पेसर आसन्न रूपांकन (पीएएम) अनुक्रम की आवश्यकता संभावित लक्ष्य अनुक्रमों की संख्या को सीमित करती है। Cas9 और इसके होमोलॉग विभिन्न PAM अनुक्रमों का उपयोग कर सकते हैं, और इसलिए संभावित लक्ष्य अनुक्रमों की संख्या का विस्तार करने के लिए सैद्धांतिक रूप से इसका उपयोग किया जा सकता है।<ref name="pmid24136345"/> #लक्ष्य लोकी की अनुक्रम विशिष्टता केवल 14 एनटी लंबी (एसजीआरएनए की 12 एनटी और पीएएम की 2एनटी) है, जो मानव जीनोम में लगभग 11 बार पुनरावृत्ति कर सकती है।<ref name="pmid24136345"/> प्रतिलेखन प्रारंभ स्थल से लक्ष्य स्थल की दूरी के साथ दमन का विपरीत संबंध है। जीनोम-व्यापी कम्प्यूटेशनल भविष्यवाणियां या लंबे PAM के साथ Cas9 होमोलॉग का चयन गैर-विशिष्ट लक्ष्यीकरण को कम कर सकता है।
#अंतर्जात क्रोमैटिन अवस्थाएं और संशोधन dCas9-sgRNA कॉम्प्लेक्स के अनुक्रम-विशिष्ट बंधन को रोक सकते हैं।<ref name="pmid24136345"/> स्तनधारी कोशिकाओं में ट्रांसक्रिप्शनल दमन का स्तर जीन के बीच भिन्न होता है। बाइंडिंग और नियामक दक्षता के संबंध में स्थानीय डीएनए संरचना और क्रोमैटिन की भूमिका को समझने के लिए बहुत काम करने की आवश्यकता है।
#CRISPRi उन जीनों को प्रभावित कर सकता है जो लक्ष्य जीन के करीब हैं। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब उन जीनों को लक्षित किया जाता है जो या तो अन्य जीनों (सेंस या एंटीसेंस ओवरलैपिंग) को ओवरलैप करते हैं या द्विदिश प्रमोटर द्वारा संचालित होते हैं।<ref>{{cite journal | vauthors = Goyal A, Myacheva K, Groß M, Klingenberg M, Duran Arqué B, Diederichs S | title = Challenges of CRISPR/Cas9 applications for long non-coding RNA genes | journal = Nucleic Acids Research | volume = 45 | issue = 3 | pages = e12 | date = February 2017 | pmid = 28180319 | pmc = 5388423 | doi = 10.1093/nar/gkw883 }}</ref>
यूकेरियोट्स में #अनुक्रम-विशिष्ट विषाक्तता की सूचना मिली है, पीएएम-समीपस्थ क्षेत्र में कुछ अनुक्रमों के कारण बड़ा फिटनेस बोझ पैदा हो रहा है।<ref>{{cite journal | vauthors = Cui L, Vigouroux A, Rousset F, Varet H, Khanna V, Bikard D | title = A CRISPRi screen in E. coli reveals sequence-specific toxicity of dCas9 | journal = Nature Communications | volume = 9 | issue = 1 | pages = 1912 | date = May 2018 | pmid = 29765036 | pmc = 5954155 | doi = 10.1038/s41467-018-04209-5 | bibcode = 2018NatCo...9.1912C }}</ref> यह घटना, जिसे ख़राब बीज प्रभाव कहा जाता है, अभी भी अस्पष्ट है लेकिन dCas9 के अभिव्यक्ति स्तर को अनुकूलित करके इसे कम किया जा सकता है।<ref>{{cite journal | vauthors = Depardieu F, Bikard D | title = Gene silencing with CRISPRi in bacteria and optimization of dCas9 expression levels | journal = Methods | volume = 172 | pages = 61–75 | date = February 2020 | pmid = 31377338 | doi = 10.1016/j.ymeth.2019.07.024 | series = Methods for characterizing, applying, and teaching CRISPR-Cas systems | s2cid = 199436713 | url = https://hal-pasteur.archives-ouvertes.fr/pasteur-02476079/file/Depardieu_Bikard_2020_Gene_silencing.pdf }}</ref>
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सीआरआईएसपीआर व्यतिकरण (सीआरआईएसपीआरआई) आनुवंशिक व्याकुलता तकनीक है जो की प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के अनुक्रम-विशिष्ट दमन की अनुमति देती है।[1] और इसे सर्वप्रथम स्टेनली क्यूई और वेंडेल लिम, एडम आर्किन, जोनाथन वीसमैन और जेनिफ़र डौडना की प्रयोगशालाओं में उनके सहयोगियों द्वारा विकसित किया गया था।[2] अतः जीन अभिव्यक्ति का अनुक्रम-विशिष्ट सक्रियण सीआरआईएसपीआर सक्रियण (सीआरआईएसपीआरए) को संदर्भित करता है।

इस प्रकार से जीवाणु आनुवंशिक प्रतिरक्षा प्रणाली पर आधारित-सीआरआईएसपीआर (संकुल नियमित रूप से अंतराल वाले छोटे पैलिंड्रोमिक दोहराव) मार्ग पर आधारित है।[3] और तकनीक आरएनए व्यतिकरण के लिए पूरक दृष्टिकोण प्रदान करती है। चूंकि, सीआरआईएसपीआरआई और आरएनएआई के मध्य अंतर यह है कि सीआरआईएसपीआरआई मुख्य रूप से ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, जबकि आरएनएआई एमआरएनए स्तर पर जीन को नियंत्रित करता है।

पृष्ठभूमि

See also: सीआरआईएसपीआर and सीआरआईएसपीआर जीन संपादन

अनेक जीवाणु और अधिकांश आर्किया में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली होती है जिसमें सीआरआईएसपीआर आरएनए (सीआरएनए) और सीआरआईएसपीआर-संबद्ध (कैस) जीन सम्मिलित होते हैं।

सीआरआईएसपीआर व्यतिकरण (सीआरआईएसपीआरआई ) तकनीक की रिपोर्ट सर्वप्रथम 2013 की प्रारंभ में सैन फ्रांसिस्को में कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय के लेई एस. क्यूई और शोधकर्ताओं द्वारा की गई थी।[2] प्रौद्योगिकी उत्प्रेरक रूप से मृत सीएएस9 (सामान्यतः डीसीएएस9 के रूप में चिह्नित) प्रोटीन का उपयोग करती है जिसमें आरएनए-निर्देशित विधियों से जीन को विनियमित करने के लिए एंडोन्यूक्लिज़ गतिविधि का अभाव होता है। इस प्रकार से लक्ष्यीकरण विशिष्टता जीनोमिक लोकस के लिए एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) की पूरक आधार-पेयरिंग द्वारा निर्धारित की जाती है। एसजीआरएनए काइमेरिक नॉनकोडिंग आरएनए है जिसे तीन क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है: अतः 20 एनटी बेस-पेयरिंग अनुक्रम, 42 एनटी डीसीएएस9-बाइंडिंग हेयरपिन और 40 एनटी टर्मिनेटर (बैक्टीरिया,[4][5][6] ख़मीर,[7] फल मक्खियाँ,[8] जेब्राफिश,[9] चूहे[10]) आदि.

इस प्रकार से सिंथेटिक एसजीआरएनए को डिजाइन करते समय, केवल 20 एनटी बेस-पेयरिंग अनुक्रम को संशोधित किया जाता है। माध्यमिक वेरिएबल पर भी विचार किया जाना चाहिए: ऑफ-टार्गेट प्रभाव (जिसके लिए बेस-पेयरिंग अनुक्रम का सरल ब्लास्ट रन आवश्यक है), डीसीएएस9-बाइंडिंग हेयरपिन संरचना का रखरखाव, और यह सुनिश्चित करना कि संशोधित एसजीआरएनए में कोई प्रतिबंध साइट उपस्तिथ नहीं है, क्योंकि इससे डाउनस्ट्रीम क्लोनिंग चरणों में समस्या उत्पन्न हो सकती है। जिससे एसजीआरएनए डिज़ाइन की सरलता के कारण, यह तकनीक जीनोम-वाइड स्केलिंग के लिए उत्तरदायी है।[11]

चूंकि सीआरआईएसपीआरआई उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय सीएएस9 की पीढ़ी पर निर्भर करता है। यह जीन एन्कोडिंग सीएएस9 के दो उत्प्रेरक अवशेषों (डी10ए और एच840ए) में बिंदु उत्परिवर्तन प्रारंभ करके पूर्ण किया गया है।[12] ऐसा करने पर, डीसीएएस9 डीएसडीएनए को तोड़ने में असमर्थ है किन्तु डीएनए को लक्षित करने की क्षमता उपस्थित रखता है। अर्थात साथ में, एसजीआरएनए और डीसीएएस9 जीन-विशिष्ट विनियमन के लिए न्यूनतम प्रणाली का निर्माण करते हैं।[2]

ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन

दमन

इस प्रकार से सीआरआईएसपीआरआई ट्रांसक्रिप्शनल दीक्षा या बढ़ाव को अवरुद्ध करके प्रतिलेखन (आनुवांशिकी) को स्थिर रूप से दबा सकता है। यह प्रवर्तक (आनुवांशिकी) या एक्सोनिक अनुक्रमों के पूरक एसजीआरएनए को डिजाइन करके पूर्ण किया जाता है। और कोडिंग अनुक्रम के अन्दर लक्ष्य के साथ ट्रांसक्रिप्शनल दमन का स्तर स्ट्रैंड-विशिष्ट है।सीआरआईएसपीआर इफ़ेक्टर की प्रकृति के आधार पर, टेम्पलेट या गैर-टेम्पलेट स्ट्रैंड सशक्त दमन की ओर ले जाता है।[13]

जिससे डीसीएएस9 (टाइप-2 सीआरआईएसपीआर प्रणाली पर आधारित) के लिए, जब गाइड आरएनए गैर-टेम्पलेट स्ट्रैंड का पूरक होता है। तब दमन अधिक सशक्त होता है। यह सुझाव दिया गया है कि यह हेलिकेज़ की गतिविधि के कारण है, जो आरएनए पोलीमरेज़ II से पहले आरएनए: डीएनए हेटेरोडुप्लेक्स को खोल देता है जब एसजीआरएनए टेम्पलेट स्ट्रैंड का पूरक होता है। तब ट्रांसक्रिप्शन बढ़ाव ब्लॉक के विपरीत, ट्रांसक्रिप्शनल स्टार्ट साइट को लक्षित करते समय साइलेंसिंग लक्षित डीएनए स्ट्रैंड से स्वतंत्र होती है। और प्रोकैरियोट्स में, यह स्थैतिक निषेध लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को लगभग 99.9% तक दबा सकता है; आर्किया में, 90% से अधिक दमन प्राप्त किया गया था;[14] इस प्रकार से मानव कोशिकाओं में 90% तक दमन देखा गया है।[2] किन्तु बैक्टीरिया में, लक्ष्य को पर्याप्त उच्च स्तर के डीसीएएस9 कॉम्प्लेक्स से संतृप्त करना संभव है। इस स्तिथि में, दमन शक्ति केवल इस संभावना पर निर्भर करती है, कि आरएनए पोलीमरेज़ के साथ टकराव पर डीसीएएस9 बाहर निकल जाता है, जो की गाइड अनुक्रम द्वारा निर्धारित होता है।[15] अतः उच्च तापमान उच्च निष्कासन संभावना से भी जुड़ा होता है, इस प्रकार नीर्बल का दमन होता है।[15] यूकेरियोट्स में, सीआरआईएसपीआरआई प्रभावक डोमेन के माध्यम से प्रतिलेखन को भी दबा सकता है। दमनकारी डोमेन को डीसीएएस9 में फ़्यूज़ करने से हेटरोक्रोमैटिनाइज़ेशन को प्रेरित करके प्रतिलेखन को और अधिक दबाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, मानव कोशिकाओं में लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को 99% तक दबाने के लिए अच्छी तरह से अध्ययन किए गए क्रुप्पेल एसोसिएटेड बॉक्स (केआरएबी ) डोमेन को डीसीएएस9 से जोड़ा जा सकता है।[16]

दक्षता में सुधार

जबकि उत्प्रेरक रूप से सक्रिय सीएएस9 न्यूक्लियस द्वारा जीनोम-संपादन अपरिवर्तनीय ऑफ-टारगेट जीनोमिक परिवर्तनों के साथ किया जा सकता है, सीआरआईएसपीआरआई दो भिन्न-भिन्न एसजीआरएनए अनुक्रमों के लिए न्यूनतम ऑफ-टारगेट प्रतिवर्ती प्रभावों के साथ अत्यधिक विशिष्ट है।[16] प्रत्येक, ट्रांसक्रिप्शनल मॉड्यूलेशन की दक्षता में सुधार के लिए अनेक विधि विकसित कि गई हैं। और लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन प्रारंभ स्थल की पहचान और एसजीआरएनए की प्राथमिकताओं पर विचार करने से दक्षता में सुधार होता है, जैसा कि लक्ष्य स्थल पर सुलभ क्रोमैटिन की उपस्थिति से होता है।[17]

अन्य विधियाँ

उल्लिखित अन्य लाभ और सीमाओं के साथ, प्रतिलेखन प्रारंभ से दूरी और स्थानीय क्रोमैटिन स्थिति जैसे कारक सक्रियण/दमन दक्षता निर्धारित करने में महत्वपूर्ण पैरामीटर हो सकते हैं। जिससे डीसीएएस9 और एसजीआरएनए अभिव्यक्ति, स्थिरता, परमाणु स्थानीयकरण और इंटरैक्शन का अनुकूलन संभवतः स्तनधारी कोशिकाओं में सीआरआईएसपीआरआई दक्षता में और सुधार की अनुमति से होता है।[2]

अनुप्रयोग

जीन नॉकडाउन

यूकेरियोट्स में जीनोम (रिपोर्टर और अंतर्जात जीन दोनों) का महत्वपूर्ण भाग आरएनएआई और टेल प्रोटीन जैसी उपस्तिथ तकनीकों की तुलनीय दक्षता के साथ, डीसीएएस9 और एसजीआरएनए को व्यक्त करने के लिए लेंटिवायरल निर्माणों का उपयोग करके लक्षित किया जा सकता है।[16] और अग्रानुक्रम में या अपनी स्वयं की प्रणाली के रूप में, सीआरआईएसपीआरआई का उपयोग आरएनएआई के समान आरएनए व्यतिकरण या अनुप्रयोग प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है।

इस प्रकार से बैक्टीरिया के लिए, सीआरआईएसपीआरआई द्वारा जीन नॉकडाउन को पूर्ण रूप से कार्यान्वित किया गया है और ग्राम-नेगेटिव E. कोली और ग्राम-पॉजिटिव बी. सबटिलिस दोनों के लिए (ऑफ-टार्गेट विश्लेषण, लीकी दमन) की विशेषता बताई गई है। [4][6][5]

जिसमे न केवल बैक्टीरिया में किन्तु आर्किया (उदाहरण के लिए, M. एसिटिवोरन्स) में भी सीआरआईएसपीआरआई-सीएएस9 का उपयोग नाइट्रोजन स्थिरीकरण से संबंधित अनेक जीन/ऑपेरॉन को नष्ट करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया था।[14]

एलिलिक श्रृंखला

लक्ष्य लोकी में एसजीआरएनए बेस-पेयरिंग की दक्षता को संशोधित करके विभेदक जीन अभिव्यक्ति प्राप्त की जा सकती है।[11] सिद्धांत रूप में, इस दक्षता को संशोधित करके किसी भी जीन के लिए एलीलिक श्रृंखला बनाने के लिए उपयोग किया जा सकता है, और संक्षेप में हाइपो- और हाइपरमोर्फ का संग्रह तैयार किया जा सकता है। इन शक्तिशाली संग्रहों का उपयोग किसी भी आनुवंशिक जांच की जांच के लिए किया जा सकता है। अतः मुलर के मॉर्फ के लिए, यह जीन नॉकआउट की द्विआधारी प्रकृति और नॉकडाउन की अप्रत्याशितता के विपरीत जीन फ़ंक्शन की वृद्धिशील कमी की अनुमति देता है। जिससे मुलर के मॉर्फ के लिए, यह वेरिएबल शक्ति वाले प्रमोटरों के अधीन रुचि के जीन की क्लोनिंग की पारंपरिक विधि के विपरीत है।

जीनोम लोकी इमेजिंग

फ्लोरोसेंट प्रोटीन को डीसीएएस9 में मिलाने से जीवित मानव कोशिकाओं में जीनोमिक लोकी की इमेजिंग की अनुमति मिलती है।[18] जिससे स्वस्थानी संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति की तुलना में, विधि विशिष्ट रूप से गुणसूत्र लोकी की गतिशील ट्रैकिंग की अनुमति देती है। इसका उपयोग हेला कोशिकाओं सहित प्रयोगशाला कोशिकाएँ लाइनों में क्रोमैटिन वास्तुकला और परमाणु संगठन की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए किया गया है।

स्टेम कोशिकाएँ

सीआरआईएसपीआरए द्वारा रिप्रोग्रामिंग के सक्रियण का उपयोग मानव और माउस कोशिकाओं प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाएँ को प्रेरित करने के लिए किया गया है जो की आईपीएस प्रौद्योगिकी के लिए वैकल्पिक विधि प्रदान करता है।[19][20] इसके अतिरिक्त, उच्च माप पर सक्रियण स्क्रीन का उपयोग उन प्रोटीनों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो की प्रेरित प्लुरिपोटेंसी को बढ़ावा देते हैं या, इसके विपरीत, एक विशिष्ट कोशिका वंश के लिए भेदभाव को बढ़ावा देते हैं।[21]

जेनेटिक स्क्रीनिंग

एकल एसजीआरएनए के साथ डीसीएएस9-सनटैग का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति को अपग्रेड करने की क्षमता उच्च माप पर आनुवंशिक स्क्रीन है, जैसे कि पर्टर्ब-सीक, के द्वार भी खोलती है, जिससे जीन अभिव्यक्ति में वृद्धि या कमी के परिणामस्वरूप होने वाले फेनोटाइप को उजागर किया जा सकता है, जो की समझने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण होता है। और कैंसर में जीन विनियमन का प्रभाव है।[22] इसके अतिरिक्त, सीआरआईएसपीआरआई प्रणाली को क्षैतिज जीन स्थानांतरण तंत्र जैसे जीवाणु संयुग्मन और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में रिपोर्टर जीन के विशिष्ट दमन के माध्यम से हस्तांतरणीय दिखाया गया है। अतः सीआरआईएसपीआरआई आनुवंशिक जांच और संभावित जीवाणु जनसंख्या नियंत्रण के लिए उपकरण के रूप में कार्य कर सकता है।[23]

लाभ और सीमाएँ

लाभ

  1. सीआरआईएसपीआरआई हित के लक्ष्य जीन को 99.9% दमन तक शांत कर सकता है।[11] और दमन की शक्ति को गाइड आरएनए और लक्ष्य के मध्य पूरकता की मात्रा को परिवर्तन करके समायोजित किया जा सकता है। प्रेरक प्रवर्तकों के विपरीत, सीआरआईएसपीआरआई द्वारा आंशिक दमन लक्ष्य की अभिव्यक्ति में ट्रांसक्रिप्शनल ध्वनि नहीं जोड़ता है।[15] चूंकि दमन का स्तर डीएनए अनुक्रम में एन्कोड किया गया है, इसलिए विभिन्न अभिव्यक्ति स्तरों को प्रतिस्पर्धा में विकसित किया जा सकता है और अनुक्रमण द्वारा पहचाना जा सकता है।[24]
  2. चूंकि सीआरआईएसपीआरआई एसजीआरएनए-डीएनए के वॉटसन-क्रिक बेस-पेयरिंग और एनजीजी पीएएम मोटिफ पर आधारित है, इसलिए जीनोम के अन्दर लक्षित साइटों का चयन सीधा और लचीला है। सावधानीपूर्वक परिभाषित प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं।[11]
  3. जिससे एकाधिक एसजीआरएनएस का उपयोग न केवल साथ अनेक भिन्न-भिन्न जीनों को नियंत्रित करने के लिए (मल्टीप्लेक्स सीआरआईएसपीआरआई ) किया जा सकता है, किन्तु जीन लक्ष्य को विनियमित करने की दक्षता को बढ़ाने के लिए भी किया जा सकता है। और अनेक एसजीआरएनए को साथ व्यक्त करने की लोकप्रिय रणनीति एसजीआरएनए को अनेक प्रमोटरों या प्रसंस्करण तत्वों के साथ ही निर्माण में व्यवस्थित करना है। इस प्रकार से उदाहरण के लिए, एक्स्ट्रा-लॉन्ग एसजीआरएनए एरेज़ (ईएलएसए) जीन संश्लेषण प्रदाता से 12-एसजीआरएनए एरेज़ के सीधे संश्लेषण की अनुमति देने के लिए गैर-दोहराव वाले भागों का उपयोग करते हैं, इसे सीधे E. कोली जीनोम में समरूप पुनर्संयोजन के बिना एकीकृत किया जा सकता है, और सम्मिश्र फेनोटाइप प्राप्त करने के लिए अनेक जीनों को लक्षित कर सकते हैं।[25]
  4. चूंकि दोनों प्रणालियाँ पूरक हो सकती हैं, सीआरआईएसपीआरआई आरएनएआई की तुलना में लाभ प्रदान करता है। बहिर्जात प्रणाली के रूप में, सीआरआईएसपीआरआई माइक्रो आरएनए अभिव्यक्ति या फ़ंक्शन जैसी अंतर्जात मशीनरी के साथ प्रतिस्पर्धा नहीं करता है। इसके अतिरिक्त, क्योंकि सीआरआईएसपीआरआई डीएनए स्तर पर कार्य करता है, कोई गैर-कोडिंग आरएनए, माइक्रोआरएनए, एंटीसेंस ट्रांसक्रिप्ट, परमाणु-स्थानीयकृत आरएनए और पोलीमरेज़ III ट्रांसक्रिप्ट जैसे ट्रांसक्रिप्ट को लक्षित कर सकता है। अंत में, सीआरआईएसपीआरआई के पास अधिक उच्च लक्षित अनुक्रम स्थान है; प्रमोटरों और, सिद्धांत रूप में, इंट्रोन्स को भी लक्षित किया जा सकता है।[16]
  5. E. कोली में, जीन नॉकडाउन स्ट्रेन का निर्माण अधिक तीव्र होता है और इसके लिए केवल एक-चरणीय ओलिगो पुनर्संयोजन की आवश्यकता होती है।[6]

सीमाएँ

  1. प्रोटोस्पेसर आसन्न रूपांकन (पीएएम) अनुक्रम की आवश्यकता संभावित लक्ष्य अनुक्रमों की संख्या को सीमित करती है। अतः सीएएस9 और इसके होमोलॉग विभिन्न पीएएम अनुक्रमों का उपयोग कर सकते हैं, और इसलिए संभावित लक्ष्य अनुक्रमों की संख्या का विस्तार करने के लिए सैद्धांतिक रूप से इसका उपयोग किया जा सकता है।[11]
  2. लक्ष्य लोकी की अनुक्रम विशिष्टता केवल 14 एनटी लंबी (एसजीआरएनए की 12एनटी और पीएएम की 2एनटी) है, जो मानव जीनोम में लगभग 11 बार पुनरावृत्ति कर सकती है।[11] जिससे प्रतिलेखन प्रारंभ स्थल से लक्ष्य स्थल की दूरी के साथ दमन का विपरीत संबंध है। अर्थात जीनोम-व्यापी कम्प्यूटेशनल पूर्वानुमान या लंबे पीएएम के साथ सीएएस9 होमोलॉग का चयन गैर-विशिष्ट लक्ष्यीकरण को कम कर सकता है।
  3. अंतर्जात क्रोमैटिन अवस्थाएं और संशोधन डीसीएएस9-एसजीआरएनए कॉम्प्लेक्स के अनुक्रम-विशिष्ट बंधन को रोक सकते हैं।[11] और स्तनधारी कोशिकाओं में ट्रांसक्रिप्शनल दमन का स्तर जीन के मध्य भिन्न होता है। किन्तु बाइंडिंग और नियामक दक्षता के संबंध में स्थानीय डीएनए संरचना और क्रोमैटिन की भूमिका को समझने के लिए अधिक कार्य करने की आवश्यकता है।
  4. सीआरआईएसपीआरआई उन जीनों को प्रभावित कर सकता है जो की लक्ष्य जीन के समीप हैं। और यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब उन जीनों को लक्षित किया जाता है या तो अन्य जीनों (सेंस या एंटीसेंस ओवरलैपिंग) को ओवरलैप करते हैं या द्विदिश प्रमोटर द्वारा संचालित होते हैं।[26]
  5. यूकेरियोट्स में अनुक्रम-विशिष्ट विषाक्तता की सूचना मिली है, कि पीएएम-समीपस्थ क्षेत्र में कुछ अनुक्रमों के कारण उच्च फिटनेस भार उत्पन्न हो रहा है।[27] यह घटना, जिसे "बीज का बुरा प्रभाव" कहा जाता है।[28] अभी भी अस्पष्ट है किन्तु डीसीएएस9 के अभिव्यक्ति स्तर को अनुकूलित करके इसे कम किया जा सकता है।

संदर्भ

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