वोल्टेज क्लैंप: Difference between revisions

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वोल्टेज क्लैंप नकारात्मक प्रतिक्रिया से संचालित होता है। झिल्ली क्षमता विभेदक प्रवर्धक कोशिका झिल्ली वोल्टेज को मापता है और प्रतिक्रिया प्रवर्धक को उत्पादन भेजता है, यह झिल्ली वोल्टेज को कमांड वोल्टेज से घटाता है, जो इसे संकेत जनरेटर से प्राप्त होता है। यह संकेत प्रवर्धित होता है और विद्युत प्रवाह-पासिंग सूक्ष्मइलेक्ट्रोड के माध्यम से अक्षतंतु में उत्पादन भेजा जाता है।

वोल्टेज क्लैंप विद्युतशरक्रिया विज्ञान द्वारा उपयोग की जाने वाली एक प्रायोगिक विधि है, जो एक निर्धारित स्तर पर झिल्ली वोल्टेज को बनाए रखते हुए, उत्तेजनीय कोशिकाओं जैसे न्यूरॉन्स की कोशिका झिल्ली के माध्यम से आयन विद्युत प्रवाह को मापने के लिए उपयोग की जाती है।^[1] एक आधारीय वोल्टेज क्लैंप झिल्ली क्षमता को पुनरावृत्त रूप से मापेगा, और फिर आवश्यक धारा जोड़कर झिल्ली क्षमता (वोल्टेज) को अपेक्षित मान में बदल देगा। यह कोशिका झिल्ली को एक अपेक्षित स्थिर वोल्टेज पर क्लैंप(जकड़) कर देता है, जिससे वोल्टेज क्लैंप को यह रिकॉर्ड करने की अनुमति मिलती है कि कौन सी धाराएं वितरित की जाती हैं। चूंकि कोशिका पर लागू धाराएं सेट वोल्टेज पर कोशिका झिल्ली में जाने वाली धारा के बराबर (और बिजली का आवेश के विपरीत) होनी चाहिए, रिकॉर्ड की गई धाराएं दर्शाती हैं कि कोशिका झिल्ली क्षमता में परिवर्तन पर कैसे प्रतिक्रिया करती है।^[2] उत्तेजक कोशिकाओं की कोशिका झिल्लियों में कई अलग-अलग प्रकार के आयन चैनल होते हैं, जिनमें से कुछ वोल्टेज-गेटेड होते हैं। वोल्टेज क्लैंप झिल्ली वोल्टेज को आयनिक धाराओं से स्वतंत्र रूप से हेरफेर करने की अनुमति देता है, जिससे झिल्ली चैनलों के वर्तमान-वोल्टेज संबंधों का अध्ययन किया जा सकता है।^[3]

इतिहास

1947 के वसंत में वोल्टेज क्लैंप की अवधारणा केनेथ कोल (इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिस्ट)^[4] और जॉर्ज मार्मोंट^[5] का श्रेय कों जाता हैं।^[6] उन्होंने एक समुद्रफेनी(समुद्री जीव एक प्रकार का घोंघा) के विशाल अक्षतंतु में एक आंतरिक इलेक्ट्रोड डाला और एक करंट लगाना शुरू किया। कोल ने पाया कि प्रयोगकर्ता द्वारा निर्धारित स्तर पर कोशिका की झिल्ली क्षमता को बनाए रखने के लिए दो इलेक्ट्रोड और एक पुनर्भरण परिपथ का उपयोग करना संभव था।

कोल ने सूक्ष्मइलेक्ट्रोड के युग से पहले वोल्टेज क्लैंप तकनीक विकसित की थी, इसलिए उनके दो इलेक्ट्रोड में विद्युत ऊष्मारोधी दंड के चारों ओर मुड़े हुए महीन तार शामिल थे। क्योंकि इस प्रकार के इलेक्ट्रोड को केवल सबसे बड़ी कोशिकाओं में डाला जा सकता है, शुरुआती इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोग लगभग विशेष रूप से समुद्रफेनी अक्षतंतु पर किए गए थे।

डॉ. जे. वाल्टर वुडबरी को दी गई केनेथ कोल की एक निजी तस्वीर

जब समुद्रफेनी को जल्दी से आगे बढ़ने की जरूरत होती है, तो वे पानी की बौछार करते हैं, जैसे कि जब वे किसी शिकारी से बचते हैं। जितनी जल्दी हो सके बचने के लिए, उनके पास एक अक्षतंतु है जो व्यास में 1 मिमी तक पहुंच सकता है (संकेत बड़े अक्षतंतु के नीचे अधिक तेज़ी से फैलते हैं)। समुद्रफेनी विशाल अक्षतंतु पहली तैयारी थी जिसका उपयोग ट्रांसमेम्ब्रेन विद्युत प्रवाह को वोल्टेज क्लैंप करने के लिए किया जा सकता था, और यह क्रिया विभव के गुणों पर हॉजकिन और हक्सले के अग्रणी प्रयोगों का आधार था।^[6]

एलन लॉयड हॉजकिन ने महसूस किया कि झिल्ली के पार आयन प्रवाह को समझने के लिए झिल्ली क्षमता में अंतर को समाप्त करना आवश्यक था।^[7] वोल्टेज क्लैंप के साथ प्रयोगों का उपयोग करते हुए, हॉजकिन और एंड्रयू हक्सले ने 1952 की गर्मियों में 5 पेपर प्रकाशित किए, जिसमें उन्होंने बताया कि कैसे आयनिक धाराएँ क्रिया विभव को जन्म देती हैं।^[8] अंतिम पेपर ने हॉजकिन-हक्सले मॉडल का प्रस्ताव दिया जो गणितीय रूप से क्रिया विभव का वर्णन करता है। क्रिया विभव का विस्तार से अध्ययन और मॉडल करने के लिए उनके प्रयोगों में वोल्टेज क्लैम्प के उपयोग ने विद्युतशरक्रिया विज्ञान की नींव रखी है, जिसके लिए उन्होंने 1963 में शरीर क्रिया विज्ञान या मेडिसिन में नोबेल पुरस्कार साझा किया था।^[7]

तकनीक

वोल्टेज क्लैंप एक वर्तमान जनित्र है। ट्रांसमेम्ब्रेन वोल्टेज जमीन के सापेक्ष वोल्टेज इलेक्ट्रोड के माध्यम से दर्ज किया जाता है, और एक धारा इलेक्ट्रोड कोशिका में विद्युत धारा का प्रवाह करता है। प्रयोगकर्ता एक होल्डिंग वोल्टेज, या कमांड क्षमता निर्धारित करता है, और वोल्टेज क्लैंप इस वोल्टेज पर कोशिका को बनाए रखने के लिए नकारात्मक प्रतिक्रिया का उपयोग करता है। इलेक्ट्रोड एक प्रवर्धक से जुड़े होते हैं, जो झिल्ली क्षमता को मापता है और संकेत को प्रतिक्रिया प्रवर्धक में दर्ज करता है। यह प्रवर्धक संकेत जनित्र से एक निविष्टि भी प्राप्त करता है जो कमांड क्षमता निर्धारित करता है, और यह झिल्ली क्षमता को कमांड क्षमता ( V_command - V_m) से घटाता हैं। किसी भी अंतर को आवर्धित करता है, और धारा इलेक्ट्रोड को एक प्रक्षेपण भेजता है। जब भी सेल होल्डिंग वोल्टेज से विचलित होता है, तो परिचालन प्रवर्धक एक त्रुटि संकेत उत्पन्न करता है, जो कि कमांड क्षमता और सेल के वास्तविक वोल्टेज के बीच का अंतर है। त्रुटि संकेत को शून्य तक कम करने के लिए प्रतिक्रिया सर्किट सेल में विद्युत धारा का प्रवाह करता है। इस प्रकार, क्लैंप सर्किट आयनिक धारा के बराबर और विपरीत धारा उत्पन्न करता है।

वोल्टेज क्लैंप तकनीक के रूपांतर

माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग करते हुए दो-इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप

दो-इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप

दो-इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप (टीईवीसी) तकनीक का उपयोग झिल्ली प्रोटीन, विशेष रूप से आयन चैनलों के गुणों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।^[9] ज़ेनोपस लेविस डिम्बाणुजनकोशिकाओ में व्यक्त झिल्ली संरचनाओं की जांच के लिए शोधकर्ता इस विधि का सबसे अधिक उपयोग करते हैं। इन डिम्बाणुजनकोशिका का बड़ा आकार आसान संचालन और परिवर्तनीय कार्य करने की अनुमति देता है।^[10]

टीईवीसी विधि दो कम प्रतिरोध वाली पतली नलिका का उपयोग करती है, एक संवेदी वोल्टेज और दूसरा अंतः क्षेपी करंट हैं। माइक्रोइलेक्ट्रोड को प्रवाहकीय समाधान से भर दिया जाता है और झिल्ली क्षमता को कृत्रिम रूप से नियंत्रित करने के लिए कोशिका में डाला जाता है। झिल्ली एक परावैद्युत के साथ-साथ प्रतिरोधक के रूप में भी कार्य करती है, जबकि झिल्ली के दोनों ओर के तरल पदार्थ संधारित्र के रूप में कार्य करते हैं।^[10] माइक्रोइलेक्ट्रोड झिल्ली क्षमता की तुलना एक कमांड वोल्टेज से करते हैं, जिससे झिल्ली में बहने वाली धाराओं का सटीक सृजन होता है। विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए सेल की विद्युत प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए वर्तमान रीडिंग का उपयोग किया जा सकता है।

यह तकनीक एकल-माइक्रोइलेक्ट्रोड क्लैंप या अन्य वोल्टेज क्लैंप तकनीकों के पक्ष में है, बड़ी धाराओं को हल करने की परिस्थितियों में इसकी आवश्यकता होती है। दो-इलेक्ट्रोड क्लैंप की उच्च विद्युत धारा-पासिंग क्षमता बड़ी धाराओं को क्लैंप करना संभव बनाती है जो एकल-इलेक्ट्रोड पैच तकनीकी के साथ नियंत्रित करना असंभव है।^[11] दो-इलेक्ट्रोड सिस्टम इसके तेज क्लैम्प स्थापित करने के समय और कम शोर के लिए भी वांछनीय है। हालांकि, टीईवीसी कोशिका आकार के संबंध में उपयोग में सीमित है। यह बड़े-व्यास वाले समुद्रफेनी में प्रभावी है, लेकिन छोटी कोशिकाओं के साथ इन्हें उपयोग करना अधिक कठिन है। इसके अतिरिक्त टीईवीसी विधि सीमित है कि धारा का ट्रांसमीटर पतली नलिका में निहित होना चाहिए। क्लैम्पिंग करते समय अंतः कोशिका तरल पदार्थ में परिवर्तन करना संभव नहीं है, जो पैच क्लैंप तकनीकों का उपयोग करना संभव है।^[2] एक और नुकसान में स्पेस क्लैंप मुद्दे शामिल हैं। केनेथ कोल ने वोल्टेज क्लैंप में एक लंबे तार का इस्तेमाल किया जो समुद्रफेनी अक्षतंतु को समान रूप से पूरी लंबाई के साथ क्लैंप करता है। टीईवीसी माइक्रोइलेक्ट्रोड विद्युत धारा का केवल एक स्थानिक बिंदु स्रोत प्रदान कर सकते हैं जो अनियमित आकार के सेल के सभी हिस्सों को समान रूप से प्रभावित नहीं कर सकता है।

दोहरे सेल वोल्टेज क्लैंप

दोहरी-सेल वोल्टेज क्लैंप तकनीक दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप की एक विशेष भिन्नता है, और इसका उपयोग केवल कोशिका अंतराल–संधि चैनलों के अध्ययन में किया जाता है।^[12] अंतराल सन्धि वह छिद्र होते हैं जो सीधे दो कोशिकाओं को जोड़ते हैं जिसके माध्यम से आयन और छोटे अणु स्वतंत्र रूप से प्रवाहित होते हैं। जब दो कोशिकाएं जिनमें अंतराल सन्धि प्रोटीन, आमतौर पर कनेक्सिन या इननेक्सिन होते हैं, या तो अंतर्जात रूप से या mRNA(एमआरएनए) के अंतः क्षेपण के माध्यम से व्यक्त किए जाते हैं, तो कोशिकाओं के बीच एक सन्धि चैनल बन जाएगा। चूंकि तंत्र में दो कोशिका उपस्थित हैं, इसलिए इलेक्ट्रोड के दो सेट का उपयोग किया जाता है। प्रत्येक सेल में एक अभिलेख इलेक्ट्रोड और एक धारा अंतः क्षेपी इलेक्ट्रोड डाला जाता है, और प्रत्येक सेल को व्यक्तिगत रूप से क्लैंप किया जाता है (इलेक्ट्रोड का प्रत्येक सेट एक अलग उपकरण से जुड़ा होता है, और प्राप्त सूचनाओं का एकीकरण कंप्यूटर द्वारा किया जाता है)। सन्धि विद्युत प्रतिरोध और चालन को दर्ज करने के लिए, पहले सेल में धारा का प्रवाह भिन्न होता है जबकि दूसरे सेल में अभिलेख इलेक्ट्रोड केवल दूसरी सेल के लिए V_m में किसी भी बदलाव को रिकॉर्ड करता है। (दूसरी सेल में होने वाली उत्तेजना और पहली सेल में होने वाली अभिलेख के साथ प्रक्रिया को उलटा किया जा सकता है।) चूंकि दर्ज किए गए सेल में इलेक्ट्रोड द्वारा धारा में कोई बदलाव नहीं किया जा रहा है, इसलिए वोल्टेज में कोई भी बदलाव अभिलेखित सेल, अंतराल सन्धि चैनलों के माध्यम से उस सेल से जिसमें धारा का प्रवाह भिन्न हैं प्रतिकूल प्रवाह से प्रेरित होना चाहिए था।^[12]

एकल-इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप

यह श्रेणी तकनीकों के एक समुच्चय का वर्णन करती है जिसमें वोल्टेज क्लैंप के लिए एक इलेक्ट्रोड का उपयोग किया जाता है। निरंतर एकल-इलेक्ट्रोड क्लैम्प (SEVC-c) तकनीक का उपयोग अक्सर पैच-क्लैंप अभिलेख के साथ किया जाता है। असंतुलित एकल-इलेक्ट्रोड वोल्टेज-क्लैंप (SEVC-d) तकनीक का उपयोग वेधक अंतःकोशिकी अभिलेख के साथ किया जाता है। यह एकल इलेक्ट्रोड धारा अंतः क्षेपण और वोल्टेज अभिलेख दोनों के कार्यों को पूरा करता है।

निरंतर एकल-इलेक्ट्रोड क्लैंप (SEVC-c)

पैच-क्लैंप तकनीक विशेष आयन चैनलों के अध्ययन की अनुमति देती है। यह एक अपेक्षाकृत बड़े टिप (> 1 माइक्रोमीटर) के साथ एक इलेक्ट्रोड का उपयोग करता है जिसमें एक चिकनी सतह होती है (एक तेज टिप के बजाय)। यह एक पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोड है (कोशिकाओं को बेधने के लिए उपयोग किए जाने वाले तेज इलेक्ट्रोड से अलग)। इस इलेक्ट्रोड को एक कोशिका झिल्ली के खिलाफ दबाया जाता है और इलेक्ट्रोड टिप के अंदर सेल की झिल्ली को खींचने के लिए चूषण यन्त्र लगाया जाता है। चूषण यन्त्र सेल को इलेक्ट्रोड के साथ एक तंग सील बनाने का कारण बनता है (एक गीगाओम सील, क्योंकि प्रतिरोध एक ओम (इकाई) से अधिक है)।

SEV-c का यह लाभ है कि आप छोटी कोशिकाओं से रिकॉर्ड कर सकते हैं जिन्हें दो इलेक्ट्रोड से लगाना असंभव होगा। हालाँकि:

माइक्रोइलेक्ट्रोड अपूर्ण कंडक्टर हैं; सामान्य तौर पर, उनका प्रतिरोध एक मिलियन ओम (यूनिट) से अधिक होता है। वे सुधार करते हैं (अर्थात, वोल्टेज के साथ अपने प्रतिरोध को बदलते हैं, अक्सर अनियमित तरीके से), कभी-कभी सेल सामग्री द्वारा अवरुद्ध होने पर उनके पास अस्थिर प्रतिरोध होता है। इस प्रकार, वे ईमानदारी से सेल के वोल्टेज को रिकॉर्ड नहीं करेंगे, खासकर जब यह जल्दी से बदल रहा हो, और न ही वे ईमानदारी से करंट पास करेंगे।
वोल्टेज और करंट त्रुटियां: SEV-c सर्किट्री वास्तव में क्लैंप किए जा रहे सेल के वोल्टेज को नहीं मापता है (जैसा कि दो-इलेक्ट्रोड क्लैंप करता है)। पैच-क्लैंप एम्पलीफायर दो-इलेक्ट्रोड क्लैंप की तरह होता है, सिवाय इसके कि वोल्टेज मापने और करंट पासिंग सर्किट जुड़े होते हैं (दो-इलेक्ट्रोड क्लैंप में, वे सेल के माध्यम से जुड़े होते हैं)। इलेक्ट्रोड एक तार से जुड़ा होता है जो एम्पलीफायर के अंदर करंट/वोल्टेज लूप से संपर्क करता है। इस प्रकार, इलेक्ट्रोड का फीडबैक सर्किट पर केवल अप्रत्यक्ष प्रभाव होता है। एम्पलीफायर केवल इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर वोल्टेज पढ़ता है, और क्षतिपूर्ति करने के लिए वर्तमान को वापस फीड करता है। लेकिन, अगर इलेक्ट्रोड एक अपूर्ण कंडक्टर है, तो क्लैंप सर्किट्री में झिल्ली क्षमता का केवल विकृत दृश्य होता है। इसी तरह, जब सर्किट उस (विकृत) वोल्टेज की भरपाई के लिए करंट को वापस भेजता है, तो सेल तक पहुंचने से पहले इलेक्ट्रोड द्वारा करंट को विकृत कर दिया जाएगा। इसकी भरपाई करने के लिए, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिस्ट सबसे कम संभव प्रतिरोध इलेक्ट्रोड का उपयोग करता है, यह सुनिश्चित करता है कि प्रयोग के दौरान इलेक्ट्रोड विशेषताओं में बदलाव न हो (इसलिए त्रुटियां स्थिर रहेंगी), और कैनेटीक्स के साथ रिकॉर्डिंग धाराओं को क्लैंप के लिए बहुत तेज होने की संभावना से बचा जाता है सटीक पालन करें। SEV-c की सटीकता धीमी हो जाती है और छोटे वोल्टेज परिवर्तन होते हैं जो इसे जकड़ने की कोशिश कर रहे हैं।
श्रृंखला प्रतिरोध त्रुटियाँ: सर्किट को पूरा करने के लिए सेल को दी जाने वाली धाराओं को जमीन पर जाना चाहिए। एम्पलीफायर द्वारा जमीन के सापेक्ष वोल्टेज रिकॉर्ड किए जाते हैं। जब किसी कोशिका को उसकी प्राकृतिक विश्राम क्षमता पर जकड़ा जाता है, तो कोई समस्या नहीं होती; क्लैंप करंट पास नहीं कर रहा है और वोल्टेज केवल सेल द्वारा उत्पन्न किया जा रहा है। लेकिन, जब एक अलग क्षमता पर दबाना होता है, तो श्रृंखला प्रतिरोध त्रुटियां चिंता का विषय बन जाती हैं; कोशिका अपनी प्राकृतिक विश्राम क्षमता पर लौटने के प्रयास में अपनी झिल्ली में करंट प्रवाहित करेगी। क्लैंप एम्पलीफायर धारण क्षमता को बनाए रखने के लिए करंट पास करके इसका विरोध करता है। एक समस्या उत्पन्न होती है क्योंकि इलेक्ट्रोड प्रवर्धक और सेल के बीच होता है; यानी, इलेक्ट्रोड प्रतिरोधी के साथ श्रृंखला में है जो सेल की झिल्ली है। इस प्रकार, जब इलेक्ट्रोड और सेल के माध्यम से करंट पास किया जाता है, तो ओम का नियम हमें बताता है कि इससे सेल और इलेक्ट्रोड के प्रतिरोध दोनों में एक वोल्टेज बनेगा। चूंकि ये प्रतिरोधक श्रृंखला में हैं, इसलिए वोल्टेज की गिरावट बढ़ जाएगी। यदि इलेक्ट्रोड और कोशिका झिल्ली में समान प्रतिरोध होते हैं (जो वे आमतौर पर नहीं करते हैं), और यदि प्रयोगकर्ता आराम करने की क्षमता से 40mV परिवर्तन की आज्ञा देता है, तो एम्पलीफायर तब तक पर्याप्त करंट पास करेगा जब तक कि वह पढ़ नहीं लेता कि उसने 40mV परिवर्तन हासिल कर लिया है। हालाँकि, इस उदाहरण में, उस वोल्टेज ड्रॉप का आधा इलेक्ट्रोड के पार है। प्रयोगकर्ता को लगता है कि उसने सेल वोल्टेज को 40 mV से स्थानांतरित कर दिया है, लेकिन इसे केवल 20 mV तक स्थानांतरित किया है। अंतर श्रृंखला प्रतिरोध त्रुटि है। आधुनिकपैच-क्लैंप एम्पलीफायरों में इस त्रुटि की भरपाई के लिए सर्किट्री होती है, लेकिन ये इसकी केवल 70-80% क्षतिपूर्ति करते हैं। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिस्ट सेल की प्राकृतिक आराम क्षमता पर या उसके पास रिकॉर्डिंग करके और यथासंभव कम प्रतिरोध इलेक्ट्रोड का उपयोग करके त्रुटि को कम कर सकता है।
समाई त्रुटियां। माइक्रोइलेक्ट्रोड कैपेसिटर हैं, और विशेष रूप से परेशान हैं क्योंकि वे गैर-रैखिक हैं। समाई उत्पन्न होती है क्योंकि इलेक्ट्रोड के अंदर इलेक्ट्रोलाइट बाहर समाधान से एक इन्सुलेटर (ग्लास) से अलग होता है। यह, परिभाषा और कार्य द्वारा, एक संधारित्र है। इससे भी बदतर, जैसे ही आप टिप से आगे बढ़ते हैं, कांच की मोटाई बदल जाती है, संधारित्र का समय अलग-अलग होगा। जब भी वे बदलते हैं तो यह झिल्ली वोल्टेज या करंट का विकृत रिकॉर्ड बनाता है। एम्पलीफायर इसकी भरपाई कर सकते हैं, लेकिन पूरी तरह से नहीं क्योंकि समाई में कई समय-स्थिरांक होते हैं। प्रयोगकर्ता कोशिका के स्नान समाधान को उथला (तरल के लिए कम कांच की सतह को उजागर करना) और सिलिकॉन, राल, पेंट, या किसी अन्य पदार्थ के साथ इलेक्ट्रोड को कोटिंग करके समस्या को कम कर सकता है जो अंदर और बाहर के समाधानों के बीच की दूरी को बढ़ा देगा।
स्पेस क्लैंप त्रुटियां। एक एकल इलेक्ट्रोड वर्तमान का एक बिंदु स्रोत है। सेल के दूर के हिस्सों में, इलेक्ट्रोड के माध्यम से प्रवाहित होने वाली धारा सेल के आस-पास के हिस्सों की तुलना में कम प्रभावशाली होगी। विस्तृत वृक्ष के समान संरचनाओं वाले न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग करते समय यह विशेष रूप से एक समस्या है। प्रयोग के निष्कर्षों को संयमित करने के अलावा स्पेस क्लैम्प त्रुटियों के बारे में कोई कुछ नहीं कर सकता है।

असंतुलित एकल-इलेक्ट्रोड वोल्टेज-क्लैंप (SEVC-d)

एक एकल-इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप — असंतत, या SEVC-d, में संपूर्ण-सेल रिकॉर्डिंग के लिए SEVC-c की तुलना में कुछ लाभ हैं। इसमें करंट पास करने और वोल्टेज रिकॉर्ड करने के लिए अलग-अलग तरीके अपनाए जाते हैं। एक एसईवीसी-डी एम्पलीफायर समय-साझाकरण के आधार पर संचालित होता है, इसलिए इलेक्ट्रोड नियमित रूप से और अक्सर वर्तमान और मापने वाले वोल्टेज के बीच स्विच करता है। असल में, दो इलेक्ट्रोड होते हैं, लेकिन प्रत्येक चालू समय के केवल आधे समय के लिए ही चालू रहता है। एकल इलेक्ट्रोड के दो कार्यों के बीच के दोलन को कर्तव्य चक्र कहा जाता है। प्रत्येक चक्र के दौरान, प्रवर्धक झिल्ली क्षमता को मापता है और इसकी तुलना धारण क्षमता से करता है। एक ऑपरेशनल एम्पलीफायर अंतर को मापता है, और एक त्रुटि संकेत उत्पन्न करता है। यह करंट सेल द्वारा उत्पन्न करंट की मिरर इमेज है। एम्पलीफायर आउटपुट में नमूना और पकड़ सर्किट होते हैं, इसलिए प्रत्येक संक्षिप्त सैंपल वोल्टेज को अगले चक्र में अगले माप तक आउटपुट पर रखा जाता है। विशिष्ट होने के लिए, एम्पलीफायर चक्र के पहले कुछ माइक्रोसेकंड में वोल्टेज को मापता है, त्रुटि संकेत उत्पन्न करता है, और शेष चक्र को उस त्रुटि को कम करने के लिए खर्च करता है। अगले चक्र की शुरुआत में, वोल्टेज को फिर से मापा जाता है, एक नया त्रुटि संकेत उत्पन्न होता है, करंट पास होता है आदि। प्रयोगकर्ता चक्र की लंबाई निर्धारित करता है, और 67 kHz के अनुरूप लगभग 15 माइक्रोसेकंड की अवधि के साथ नमूना लेना संभव है। आवृत्ति बदलना। 1 मिलीसेकंड से कम चौड़े एक्शन पोटेंशिअल के साथ काम करते समय लगभग 10 kHz से कम स्विचिंग फ़्रीक्वेंसी पर्याप्त नहीं होती हैं। ध्यान दें कि सभी बंद वोल्टेज-क्लैंप एम्पलीफायर 10 kHz से अधिक स्विचिंग आवृत्तियों का समर्थन नहीं करते हैं।^[10]

इसके लिए काम करने के लिए, सेल कैपेसिटेंस कम से कम परिमाण के क्रम से इलेक्ट्रोड कैपेसिटेंस से अधिक होना चाहिए। समाई धाराओं के कैनेटीक्स (उठने और गिरने के समय) को धीमा कर देती है। यदि इलेक्ट्रोड कैपेसिटेंस सेल की तुलना में बहुत कम है, तो जब इलेक्ट्रोड के माध्यम से करंट पास किया जाता है, तो इलेक्ट्रोड वोल्टेज सेल वोल्टेज की तुलना में तेजी से बदलेगा। इस प्रकार, जब करंट इंजेक्ट किया जाता है और फिर बंद कर दिया जाता है (एक कर्तव्य चक्र के अंत में), इलेक्ट्रोड वोल्टेज सेल वोल्टेज की तुलना में तेजी से क्षय होगा। जैसे ही इलेक्ट्रोड वोल्टेज सेल वोल्टेज के स्पर्शोन्मुख होता है, वोल्टेज का नमूना (फिर से) लिया जा सकता है और चार्ज की अगली मात्रा लागू की जा सकती है। इस प्रकार, कर्तव्य चक्र की आवृत्ति उस गति तक सीमित होती है जिस पर वर्तमान प्रवाह करते समय इलेक्ट्रोड वोल्टेज बढ़ता और घटता है। इलेक्ट्रोड कैपेसिटेंस जितना कम होगा, उतनी ही तेजी से साइकिल चल सकती है।

प्रयोगकर्ता को झिल्ली क्षमता को मापने की अनुमति देने में SEVC-d का SEVC-c पर एक बड़ा फायदा है, और, क्योंकि यह एक ही समय में वर्तमान और मापने वाले वोल्टेज को पारित करने से रोकता है, कभी भी श्रृंखला प्रतिरोध त्रुटि नहीं होती है। मुख्य नुकसान यह है कि समय संकल्प सीमित है और एम्पलीफायर अस्थिर है। यदि यह बहुत अधिक करंट पास करता है, ताकि गोल वोल्टेज ओवर-शॉट हो जाए, तो यह अगले कर्तव्य चक्र में करंट की ध्रुवीयता को उलट देता है। यह लक्ष्य वोल्टेज को कम करने का कारण बनता है, इसलिए अगला चक्र फिर से इंजेक्शन की ध्रुवीयता को उलट देता है। यह त्रुटि प्रत्येक चक्र के साथ तब तक बढ़ सकती है जब तक कि एम्पलीफायर नियंत्रण से बाहर न हो जाए ("रिंगिंग"); यह आमतौर पर रिकॉर्ड किए जा रहे सेल के विनाश के परिणामस्वरूप होता है। अन्वेषक अस्थायी समाधान में सुधार के लिए एक छोटा कर्तव्य चक्र चाहता है; एम्पलीफायर में समायोज्य कम्पेसाटर होते हैं जो इलेक्ट्रोड वोल्टेज को तेजी से क्षय कर देंगे, लेकिन, अगर ये बहुत अधिक सेट हैं तो एम्पलीफायर बज जाएगा, इसलिए अन्वेषक हमेशा एम्पलीफायर को "ट्यून" करने की कोशिश कर रहा है जितना संभव हो उतना अनियंत्रित दोलन के किनारे के करीब, ऐसी स्थिति में रिकॉर्डिंग स्थितियों में छोटे-छोटे बदलाव रिंगिंग का कारण बन सकते हैं। दो समाधान हैं: एम्पलीफायर सेटिंग्स को एक सुरक्षित सीमा में "बैक ऑफ" करना, या संकेतों के लिए सतर्क रहना कि एम्पलीफायर बजने वाला है।

गणितीय मॉडलिंग

नियंत्रण सिद्धांत के दृष्टिकोण से, वोल्टेज क्लैंप प्रयोग को उच्च-लाभ आउटपुट फीडबैक नियंत्रण कानून के आवेदन के संदर्भ में वर्णित किया जा सकता है।^[13] न्यूरोनल झिल्ली को।^[14] गणितीय रूप से, झिल्ली वोल्टेज को हॉजकिन-हक्सले मॉडल द्वारा तैयार किया जा सकता है। चालन-आधारित मॉडल लागू वर्तमान द्वारा दिए गए इनपुट के साथ $I_{app}(t)$ और झिल्ली वोल्टेज द्वारा दिया गया एक आउटपुट $V(t)$ . हॉजकिन और हक्सले का मूल चालन-आधारित मॉडल, जो सोडियम और पोटेशियम आयन चैनल युक्त एक न्यूरोनल झिल्ली का प्रतिनिधित्व करता है, साथ ही एक रिसाव (इलेक्ट्रॉनिक्स), साधारण अंतर समीकरणों की प्रणाली द्वारा दिया जाता है

$C_{m}{\frac {dV}{dt}}=-{\bar {g}}_{\text{K}}n^{4}(V-V_{\text{K}})-{\bar {g}}_{\text{Na}}m^{3}h(V-V_{\text{Na}})-{\bar {g}}_{\text{L}}(V-V_{L})+I_{app}$

${\frac {dp}{dt}}=\alpha _{p}(V)(1-p)-\beta _{p}(V)p,\quad p=m,n,h$ कहाँ $C_{m}$ झिल्ली समाई है, ${\bar {g}}_{\text{Na}}$ , ${\bar {g}}_{\text{K}}$ और ${\bar {g}}_{\text{L}}$ अधिकतम चालन हैं, $V_{\text{Na}}$ , $V_{\text{K}}$ और $V_{\text{L}}$ उत्क्रमण क्षमता हैं, $\alpha _{p}$ और $\beta _{p}$ आयन चैनल वोल्टेज-निर्भर दर स्थिरांक और राज्य चर हैं $m$ , $h$ , और $n$ आयन चैनल हॉजकिन-हक्सले मॉडल # आयनिक वर्तमान लक्षण वर्णन हैं।

फीडबैक कानून को सख्ती से दिखाना संभव है

$I_{app}(t)=k(V_{\text{ref}}-V(t))$ झिल्ली वोल्टेज चलाता है $V(t)$ मनमाने ढंग से संदर्भ वोल्टेज के करीब $V_{\text{ref}}$ लाभ के रूप में $k>0$ एक मनमाने ढंग से बड़े मूल्य में वृद्धि हुई है।^[14]यह तथ्य, जो किसी भी तरह से डायनेमिक सिस्टम की सामान्य संपत्ति नहीं है (एक उच्च-लाभ, सामान्य रूप से, अस्थिरता की ओर ले जा सकता है)^[15]), उपरोक्त आचरण-आधारित मॉडल की संरचना और गुणों का परिणाम है। विशेष रूप से, प्रत्येक गेटिंग चर की गतिशीलता $p=m,h,n$ , जिसके द्वारा संचालित हैं $V$ घातांकीय संकुचन के प्रबल स्थिरता सिद्धांत की जाँच करें।^[14]^[16]

संदर्भ

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@@ Line 27: / Line 27: @@
 === एकल-इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप ===
-यह श्रेणी तकनीकों के एक सेट का वर्णन करती है जिसमें वोल्टेज क्लैंप के लिए एक इलेक्ट्रोड का उपयोग किया जाता है। निरंतर एकल-इलेक्ट्रोड क्लैम्प (SEVC-c) तकनीक का उपयोग अक्सर पैच-क्लैंप अभिलेख के साथ किया जाता है। असंतुलित एकल-इलेक्ट्रोड वोल्टेज-क्लैंप (SEVC-d) तकनीक का उपयोग वेधक अंतःकोशिकी अभिलेख के साथ किया जाता है। यह एकल इलेक्ट्रोड धारा अंतः क्षेपण और वोल्टेज अभिलेख दोनों के कार्यों को पूरा करता है।
+यह श्रेणी तकनीकों के एक समुच्चय का वर्णन करती है जिसमें वोल्टेज क्लैंप के लिए एक इलेक्ट्रोड का उपयोग किया जाता है। निरंतर एकल-इलेक्ट्रोड क्लैम्प (SEVC-c) तकनीक का उपयोग अक्सर पैच-क्लैंप अभिलेख के साथ किया जाता है। असंतुलित एकल-इलेक्ट्रोड वोल्टेज-क्लैंप (SEVC-d) तकनीक का उपयोग वेधक अंतःकोशिकी अभिलेख के साथ किया जाता है। यह एकल इलेक्ट्रोड धारा अंतः क्षेपण और वोल्टेज अभिलेख दोनों के कार्यों को पूरा करता है।
 ==== निरंतर एकल-इलेक्ट्रोड क्लैंप (SEVC-c) ====
 {{Unreferenced section|date=May 2013}}
-{{Main|patch clamp}}
+{{Main|पैच-क्लैंप}}
-पैच-क्लैंप तकनीक व्यक्तिगत आयन चैनलों के अध्ययन की अनुमति देती है। यह एक अपेक्षाकृत बड़े टिप (> 1 माइक्रोमीटर) के साथ एक इलेक्ट्रोड का उपयोग करता है जिसमें एक चिकनी सतह होती है (एक तेज टिप के बजाय)। यह एक पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोड है (कोशिकाओं को इम्पेल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तेज इलेक्ट्रोड से अलग)। इस इलेक्ट्रोड को एक कोशिका झिल्ली के खिलाफ दबाया जाता है और इलेक्ट्रोड टिप के अंदर सेल की झिल्ली को खींचने के लिए सक्शन लगाया जाता है। सक्शन सेल को इलेक्ट्रोड के साथ एक तंग सील बनाने का कारण बनता है (एक गीगाओम सील, क्योंकि प्रतिरोध एक [[ओम (इकाई)]] से अधिक है)।
+पैच-क्लैंप तकनीक विशेष आयन चैनलों के अध्ययन की अनुमति देती है। यह एक अपेक्षाकृत बड़े टिप (> 1 माइक्रोमीटर) के साथ एक इलेक्ट्रोड का उपयोग करता है जिसमें एक चिकनी सतह होती है (एक तेज टिप के बजाय)। यह एक पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोड है (कोशिकाओं को बेधने के लिए उपयोग किए जाने वाले तेज इलेक्ट्रोड से अलग)। इस इलेक्ट्रोड को एक कोशिका झिल्ली के खिलाफ दबाया जाता है और इलेक्ट्रोड टिप के अंदर सेल की झिल्ली को खींचने के लिए चूषण यन्त्र लगाया जाता है। चूषण यन्त्र सेल को इलेक्ट्रोड के साथ एक तंग सील बनाने का कारण बनता है (एक गीगाओम सील, क्योंकि प्रतिरोध एक [[ओम (इकाई)]] से अधिक है)।
 SEV-c का यह लाभ है कि आप छोटी कोशिकाओं से रिकॉर्ड कर सकते हैं जिन्हें दो इलेक्ट्रोड से लगाना असंभव होगा। हालाँकि:

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