प्रोटीन अवक्षेपण

प्रोटीन को केंद्रित करने और उन्हें विभिन्न दूषित पदार्थों से शुद्ध करने के लिए जैविक उत्पादों के अधः प्रवाह प्रसंस्करण में प्रोटीन अवक्षेपण का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, जैव प्रौद्योगिकी उद्योग में प्रोटीन अवक्षेपण का उपयोग प्रायः रक्त में उपस्थित दूषित पदार्थों को खत्म करने के लिए किया जाता है। अवक्षेपण का अंतर्निहित तंत्र एक अभिकर्मक के अतिरिक्त विलेय की विलेयता को कम करके, विशेष रूप से, विलायक की घुलनशीलता  को परिवर्तित करना है।

सामान्य सिद्धांत

जलीय बफ़र् में प्रोटीन की घुलनशीलता प्रोटीन की सतह पर  जलस्‍नेही और जलविरागी एमीनो अम्ल अवशेषों के वितरण पर निर्भर करती है।जलविरागी अवशेष मुख्य रूप से गोलाकार प्रोटीन कोर में होते हैं, लेकिन कुछ सतह पर पैच में उपस्थित होते हैं। जिन प्रोटीनों की सतह पर उच्च जलविरागी एमीनो अम्ल सामग्री होती है, उनमें जलीय विलायक में कम घुलनशीलता होती है। आवेशित और ध्रुवीय सतह के अवशेष विलायक में आयनिक समूहों के साथ परस्पर क्रिया करते हैं और प्रोटीन की विलेयता को बढ़ाते हैं।एक प्रोटीन के अमीनो अम्ल संरचना का ज्ञान एक आदर्श अवक्षेपण  विलायक और विधियों को निर्धारित करने में सहायता करेगा।

प्रतिकर्षक स्थिर वैद्युत विक्षेप बल

प्रतिकर्षक स्थिर वैद्युत विक्षेप बल तब उत्पन्न होता हैं जब विद्युत् अपघट्य विलयन में प्रोटीन घुल जाती है। प्रोटीन के मध्य ये प्रतिकर्षक  बल एकत्रीकरण को रोकते हैं और विघटन की सुविधा प्रदान करते हैं।  विद्युत् अपघट्य विलयन में घुलने पर, विलायक काउंटर प्रोटीन पर आवेशित किए गए सतह अवशेषों की ओर पलायन करते हैं, जिससे प्रोटीन की सतह पर काउंटरों का एक कठोर सांचा बनता है। इस परत के समीप एक और विलायक परत है जो कम कठोर है और जैसे ही यह प्रोटीन की सतह से दूर जाता है, उसमें एक कमी होती है,काउंटरों की घटती सांद्रता और सह-आयनों की बढ़ती सांद्रता सम्मिलित है। इन विलायकयोजन परतों की उपस्थिति के कारण प्रोटीन का अन्य प्रोटीनों के साथ कम आयनिक संपर्क होता है और एकत्रीकरण की संभावना कम हो जाती है। प्रतिकर्षक स्थिर वैद्युत विक्षेप बल तब उत्पन्न होता हैं जब प्रोटीन जल में घुल जाता  हैं। जल एक प्रोटीन के जलंरागी सतह अवशेषों के चारों ओर एक विलायक परत बनाता है। पानी उच्चतम सांद्रता के साथ प्रोटीन के चारों ओर एक सांद्रता प्रवणता स्थापित करता है।

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  आयोनिक सॉल्वेशन परत

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  जलयोजन परत

आकर्षक स्थिर वैद्युत विक्षेप बल

स्थायी और प्रेरित द्विध्रुवों के माध्यम से प्रोटीन के बीच फैलाव या आकर्षक बल उपस्थित होते हैं। उदाहरण के लिए, एक प्रोटीन पर मूल अवशेषों में अन्य प्रोटीन पर अम्लीय अवशेषों के साथ स्थिर वैद्युत विक्षेप पारस्परिक प्रभाव हो सकते हैं। यद्यपि विद्युत् अपघटनी विलयन या जल में आयनों द्वारा विलायक योजन प्रोटीन-प्रोटीन आकर्षक बलों को कम करेगा। इसलिए, प्रोटीन के संचय को तीव्र या प्रेरित करने के लिए, प्रोटीन के चारों ओर जलयोजन परत को कम किया जाना चाहिए।प्रोटीन अवक्षेपण में संयोजित किये गए अभिकर्मकों का उद्देश्य जलयोजन परत को कम करना है।

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  जलयोजन परत

अवक्षेपण गठन

प्रोटीन अवक्षेप का निर्माण एक चरणबद्ध प्रक्रिया में होता है। सबसे पहले, एक अवक्षेपण एजेंट जोड़ा जाता है और विलयन निरंतर मिश्रित होता है।  विलयन को मिलाने से अवक्षेपक और प्रोटीन आपस में टकराते हैं। द्रव भंवरों में अणुओं के विसरण के लिए पर्याप्त मिश्रण की आवश्यकता होती है। इसके बाद, प्रोटीन एक नाभिकन चरण से गुजरते हैं, जहां अतिसूक्ष्म आकार के प्रोटीन समुच्चय या कण उत्पन्न होते हैं। इन कणों की वृद्धि ब्राउनियन विसरण नियंत्रण के अंतर्गत होती है।इन कणों की वृद्धि ब्राउनियन विसरण नियंत्रण के अंतर्गत होती है। एक बार जब कण एक महत्वपूर्ण आकार (क्रमशः उच्च और निम्न अपरुपण क्षेत्रों के लिए 0.1 माइक्रोन से 10 माइक्रोन) तक पहुंच जाते हैं, तो इसमें अलग-अलग प्रोटीन अणुओं के विसारक योग से, वे एक-दूसरे से टकराकर और संलगन या ऊर्णी कर्मक रूप से बढ़ते रहते हैं। यह चरण धीमी गति से होता है। अंतिम चरण के दौरान, जिसे अपरुपण क्षेत्र में काल प्रभावन कहा जाता है, अवक्षेपित कण बार-बार टकराते और संलग्नित होते हैं, फिर एक स्थिर औसत कण तक अलग हो जाते हैं, प्रोटीन कणों की यांत्रिक शक्ति औसत अपरुपण दर और जरण काल  के उत्पाद से संबंधित होती है, जिसे शिविर संख्या के रूप में जाना जाता है। जरण वृद्धि से कणों को आकार में कमी किए बिना पंपों और अपकेंद्रित संभरण क्षेत्र में आने वाले द्रव अपरुपण बलों का सामना करने में सहायता मिलती है।

लवण निर्गम

प्रोटीन को अवक्षेपित करने के लिए उपयोग की जाने वाली सबसे प्रचलित विधि लवण निर्गम है। अमोनियम सल्फेट जैसे नमक को मिलाने से विलायकयोजन परत संकुचित हो जाती है और प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रिया में वृद्धि होती है। जैसे ही एक विलयन के नमक की सांद्रता बढ़ जाती है, प्रोटीन की सतह पर आवेश जल के साथ परस्पर क्रिया न करके नमक के साथ परस्पर क्रिया करता है, जिससे प्रोटीन की सतह पर जलभीत पैच उद्भासित होती है और प्रोटीन विलयन से बाहर गिर जाता है।

लवण निर्गमन में सम्मिलित ऊर्जां

नमक निर्गम एक सहज प्रक्रिया है जब नमक की सही सांद्रता विलयन में पहुँच जाती है। प्रोटीन की सतह पर जलभीत पैच अत्यधिक क्रमबद्ध जल के कोष उत्पन्न करते हैं। इसके परिणामस्वरूप समष्टि विलयन में अणुओं के सापेक्ष सुव्यवस्थित जल के अणुओं की एन्थैल्पी ΔH, और एंट्रॉपी, ΔS में एक विस्तृत कमी आती है। प्रक्रिया में उत्पन्न समग्र मुक्त ऊर्जा परिवर्तन, ΔG, गिब्स मुक्त ऊर्जा समीकरण द्वारा दिया गया है:

$\Delta G=\Delta H-T\Delta S.$

ΔG = मुक्त ऊर्जा परिवर्तन, ΔH = अवक्षेपण पर एन्थैल्पी परिवर्तन, ΔS = अवक्षेपण पर एन्ट्रापी परिवर्तन, T = निरपेक्ष तापमान। जब कठोर विलायक योजन परत में जल के अणुओं को संयोजित नमक के साथ पारस्परिक क्रिया के माध्यम से विस्तृत चरण में वापस लाया जाता है, तो उनकी गति की स्वतंत्रता उनके एंट्रॉपी में महत्वपूर्ण वृद्धि का कारण बनती है। इस प्रकार, ΔG ऋणात्मक हो जाता है और अवक्षेपण अनायास होता है।

हॉफमिस्टर श्रृंखला

कोस्मोट्रोप् या "जल संरचना स्थिरक" लवण होते हैं जो एक प्रोटीन के चारों ओर विलायकयोजन परत से जल के अपव्यय/फैलाव को बढ़ावा देते हैं। इसके उपरांत जलभीत पैच प्रोटीन की सतह पर अनावृत होती  हैं, और ये अन्य प्रोटीनों पर विलायकयोजन पैच के साथ पारस्परिक क्रिया करते हैं। ये लवण प्रोटीन एकत्रीकरण और अवक्षेपण को बढ़ाते हैं। विपर्यस्तर या "जल संरचना विभाजक ",कोस्मोट्रोप् के विपरीत प्रभाव डालते हैं। ये लवण एक प्रोटीन के चारों ओर विलायकयोजन परत में वृद्धि करते हैं। अवक्षेपित प्रोटीन में कोस्मोट्रोपिक लवण की प्रभावशीलता हॉफमिस्टर श्रृंखला के क्रम का अनुसरण करती है:

सर्वाधिक वर्षा $\mathrm {PO_{4}^{3-}>SO_{4}^{2-}>COO^{-}>Cl^{-}}$ सबसे कम वर्षा

सर्वाधिक वर्षा $\mathrm {NH_{4}^{+}>K^{+}>Na^{+}}$ सबसे कम वर्षा

व्यवहार में लवण निर्गम

प्रोटीन घुलनशीलता में कमी सामान्यीकृत घुलनशीलता वक्र का पालन करती है। एक प्रोटीन की विलेयता और विलयन की बढ़ती आयनिक शक्ति के बीच संबंध कोहन समीकरण द्वारा दर्शाया जा सकता है:

$\log S=B-KI\,$

S = प्रोटीन की घुलनशीलता, B आदर्शित घुलनशीलता है, K एक नमक-विशिष्ट स्थिरांक है और I विलयन की आयनिक शक्ति है, जिसे संयोजित नमक के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है।

$I={\begin{matrix}{\frac {1}{2}}\end{matrix}}\sum _{i=1}^{n}c_{i}z_{i}^{2}$ zi नमक का आयन आवेश है और ci नमक की सघनता है। प्रोटीन अवक्षेपण के लिए आदर्श नमक एक विशेष एमीनो अम्ल संरचना,जो  सस्ती, गैर-बफरिंग और गैर-प्रदूषणकारी के लिए सबसे प्रभावी है। सबसे अधिक प्रयोग किया जाने वाला नमक अमोनियम सल्फेट है। 0 डिग्री सेल्सियस से 30 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर लवण निर्माण  कम भिन्नता है। उच्च नमक सांद्रता द्वारा प्रोटीन अपघटन और जीवाणु संदूषण से सुरक्षित नमक के विलयन में बचा हुआ प्रोटीन वर्षों तक स्थिर रह सकता है।

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  घुलनशीलता वक्र

समविद्युत अवक्षेपण

समविभवी बिंदु (PI) एक विलयन का pH है जिस पर प्रोटीन का शुद्ध प्राथमिक प्रभार शून्य हो जाता है। एक विलयन pH में जो PI से ऊपर है, प्रोटीन की सतह मुख्य रूप से नकारात्मक रूप से आवेशित होती है और इसलिए आवेशित किए गए अणु प्रतिकर्षक शक्तियों का प्रदर्शन करेंगे। इसी तरह, एक विलयन pH पर जो PI से नीचे है, प्रोटीन की सतह मुख्य रूप से सकारात्मक रूप से आवेशित होती है और प्रोटीन के बीच प्रतिकर्षण होता है। यद्यपि pI पर ऋणात्मक और धनात्मक आवेश निरसन प्रतिकर्षक होते हैं, प्रतिकर्षक स्थिर वैद्युत विक्षेप बल कम हो जाते हैं और आकर्षण बल प्रबल हो जाते हैं। आकर्षण बल एकत्रीकरण और अवक्षेपण का कारण बनेंगे। अधिकांश प्रोटीन का PI 4-6 की pH श्रेणी में होता है। हाइड्रोक्लोरिक और सल्फ्यूरिक अम्ल जैसे खनिज अम्ल अवक्षेपक के रूप में उपयोग किए जाते हैं। समविभवी बिंदु अवक्षेपण की सबसे बदाधिक हानि खनिज अम्ल की वजह से अपरिवर्तनीय विकार है।इस कारण से संदूषित प्रोटीन के अतिरिक्त समविभवी बिंदु अवक्षेपण  का उपयोग प्रायः  दूषित प्रोटीनों को अवक्षेपित करने के लिए किया जाता है। चीज़ बनाने के दौरान या सोडियम केसिनेट के उत्पादन के दौरान दूध के प्रोटीन का अवक्षेपण एक समविद्युत अवक्षेपण है।

विलेयशील विलायक के साथ अवक्षेपण

मिश्रणीय विलायक जैसे कि इथेनॉल या मेथनॉल को एक विलयन में मिलाने से विलयन में प्रोटीन अवक्षेपित हो सकता है। प्रोटीन के चारों ओर विलायक योजन परत कम हो जाएगी क्योंकि कार्बनिक विलायक उत्तरोत्तर प्रोटीन की सतह से जल को विस्थापित करता है और इसे कार्बनिक विलायक अणुओं के चारों ओर जलयोजन परतों में बांधता है। छोटी जलयोजन परतों के साथ, प्रोटीन आकर्षक स्थिर वैद्युत भंडारण और द्विध्रुवीय बलों द्वारा एकत्रित हो सकते हैं। विचार करने के लिए महत्वपूर्ण मापदंड तापमान हैं, जो कम होना चाहिए, जो विलयन में विकार, pH और प्रोटीन सांद्रता से बचने के लिए 0 डिग्री सेल्सियस से कम होना चाहिए। घुलनशील कार्बनिक विलायक जल के परावैद्युत स्थिरांक को कम करते हैं, जो प्रभाव में दो प्रोटीनों को एक साथ आने की अनुमति देता है। समविभवी बिंदु पर परावैद्युत स्थिरांक और प्रोटीन घुलनशीलता के बीच संबंध निम्न द्वारा दिया जाता है

$\log S=k/e^{2}+\log S^{0}\,$

S0, S का बहिर्वेशित मान है, e मिश्रण का अचालक स्थिरांक है और k एक स्थिरांक है जो पानी केअचालक स्थिरांक से संबंधित है। प्लाज्मा प्रोटीन विभाजन के लिए कोन प्रक्रिया व्यक्तिगत प्लाज्मा प्रोटीन को अलग करने के लिए इथेनॉल के साथ विलायक अवक्षेपण पर निर्भर करती है।।

बिलीरुबिन के अनुमान में एक प्रोटीन अवक्षेपक एजेंट के रूप में मेथनॉल के उपयोग के लिए एक नैदानिक ​​अनुप्रयोग है।

गैर-आयनिक जलंरागी बहुलक

बहुलक, जैसे कि डेक्सट्रान और पॉलीइथाइलीन ग्लाइकोल, प्रायः प्रोटीन को अवक्षेपित करने के लिए उपयोग किए जाते हैं क्योंकि उनकी ज्वलनशीलता कम होती है और समविभवी अवक्षेपण की तुलना में जैव पदार्थ को विकृत करने की संभावना कम होती है। विलयन में ये बहुलक जल के अणुओं को प्रोटीन के चारों ओर विलायकयोजन परत से दूर आकर्षित करते हैं। यह प्रोटीन-प्रोटीन पारस्परिक क्रिया को बढ़ाता है और अवक्षेपण में वृद्धि करता है। पॉलीथीन ग्लाइकोल के विशिष्ट कारको के लिए, समीकरण द्वारा अवक्षेपण मॉडल तैयार किया जा सकता है:

$\ln(S)+pS=X-aC\,$

C बहुलक सांद्रता है, P प्रोटीन-प्रोटीन पारस्परिक गुणांक है, प्रोटीन-बहुलक परस्परिक गुणांक है और

$x=(\mu _{i}-\mu _{i}^{0})RT$

μ घटक I की रासायनिक क्षमता है, R सार्वभौमिक गैस स्थिरांक है और T पूर्ण तापमान है।

बहुविद्युतअपघट्य द्वारा ऊर्णन

एल्गिनेट, कार्बोक्सिमिथाइलसेलुलोज, पॉलीएक्रेलिक अम्ल , टैनिक अम्ल और पॉलीफॉस्फेट विलयन में प्रोटीन अणुओं के बीच विस्तारित नेटवर्क बना सकते हैं। इन बहुविद्युतअपघट्य की प्रभावशीलता विलयन के pH पर निर्भर करती है। आयनिक बहुविद्युतअपघट्य का उपयोग समविभवी बिंदु से कम pH मान पर किया जाता है। धनआयनिक बहुविद्युतअपघट्य  pI के ऊपर pH मान पर उपस्थित  हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि बहुविद्युतअपघट्य की अधिकता अवक्षेप को विलयन में स्थान्तरित करती है समविभवी ऊर्णन का एक उदाहरण आयरलैंड की काई  का उपयोग करके बीयर के पौधे से प्रोटीन आवरण को हटाना है। ।

बहुसंयोजक धात्विक आयन

विलयनों से एंजाइमों और न्यूक्लिक अम्लों को अवक्षेपित करने के लिए धातु के लवणों का उपयोग कम सांद्रता में किया जा सकता है। बहुसंयोजक धातु आयनों Ca2, Mg2, Mn2 या फ२ का प्रायः उपयोग किया जाता है।

अवक्षेपण रिएक्टर

बड़ी मात्रा में प्रोटीन को अवक्षेपित करने के लिए उपयोग किए जाने की तुलना में कई औद्योगिक पैमाने वाले रिएक्टर हैं, जैसे कि एक विलयन से पुनः संयोजक DNAपोलीमरेज़।। [1]

घान रिएक्टर

घान रिएक्टर अवक्षेपण रिएक्टर का सबसे सरल प्रकार है। मिश्रण के तहत अवक्षेपण एजेंट को धीरे-धीरे प्रोटीन विलयन में सयोजित किया  जाता है। एकत्रित प्रोटीन कण आकार में सघन और नियमित होते हैं। चूंकि कण लंबे समय तक अपरुपण तनाव की एक विस्तृत श्रृंखला के संपर्क में आते हैं, इसलिए वे सघन, घने और यांत्रिक रूप से स्थिर होते हैं।

नलिकाकार रिएक्टर

नलिकाकार रिएक्टरों में, प्रबंधन प्रोटीन विलयन और अवक्षेपण अभिकर्मक को कुशल मिश्रण के क्षेत्र के संपर्क में रखा जाता है, इसके बाद इसे लंबी नलिकाओं में प्रबंधित किया जाता है जहां अवक्षेपण  होता है। आयातनिक तत्वों में तरल पदार्थ अवरोधक प्रवाह तक पहुंचता है क्योंकि ये रिएक्टर की नलिकाओं के माध्यम से चलते हैं। नलिका में तार जाल आवेषण के माध्यम से अशांत प्रवाह को बढ़ाया  जाता है। नलिकाकार रिएक्टर को  गतिमान यांत्रिक भागों की आवश्यकता नहीं होती है और यह निर्माण के लिए कम खर्च वाले है। यद्यपि रिएक्टर अव्यावहारिक रूप से लंबा हो सकता है यदि कण धीरे-धीरे एकत्रित होते हैं।

सतत द्रवित टैंक रिएक्टर (CSTR)

CSTR रिएक्टर एक अच्छी तरह से मिश्रित टैंक में अभिकारकों और उत्पादों के निरंतर प्रवाह के साथ स्थिर अवस्था में चलते हैं। ताजा प्रोटीन प्रभरण संपर्क विलयन जिसमें पहले से ही अवक्षेपित कण और अवक्षेपण अभिकर्मक होते हैं

संदर्भ

• Zellner; et al. (June 2005). "Quantitative validation of different protein precipitation methods in proteome analysis of blood platelets". Electrophoresis. 26 (12): 2481–9. doi:10.1002/elps.200410262. PMID 15895463.
• Harrison et al., Bioseparations Science and Engineering. Oxford University Press. New York, NY 2003.
• Shuler et al., Bioprocess Engineering: Basic Concepts (2nd Edition). Prentice Hall International. 2001
• Ladisch. Bioseparations Engineering. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY 2001.
• Lydersen. Bioprocess Engineering. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY 1994.
• Belter, Paul A. Bioseparations: downstream processing for biotechnology. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY 1988.