कोलोकलाइज़ेशन

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प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में, कोलोकलाइज़ेशन दो (या अधिक) विभिन्न फ्लोरोसेंट लेबल के बीच स्थानिक ओवरलैप के अवलोकन को संदर्भित करता है, प्रत्येक में एक अलग उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य होता है, यह देखने के लिए कि क्या अलग-अलग लक्ष्य सेल के एक ही क्षेत्र में स्थित हैं या एक दूसरे के बहुत निकट हैं। . परिभाषा को दो अलग-अलग घटनाओं में विभाजित किया जा सकता है, सह-घटना, जो एक ही पिक्सेल में दो (संभवतः असंबंधित) फ्लोरोफोरस की उपस्थिति को संदर्भित करती है, और सहसंबंध, फ्लोरोफोरस के बीच बहुत अधिक महत्वपूर्ण सांख्यिकीय संबंध एक जैविक बातचीत का संकेत है।[1]जैव-अणुओं के जोड़े के बीच संबंधों के प्रदर्शन के दौरान यह तकनीक कई सेल जैविक और शारीरिक अध्ययनों के लिए महत्वपूर्ण है।

इतिहास

जैव-अणुओं की एक जोड़ी के बीच एक सहसंबंध प्रदर्शित करने की क्षमता एम्स्टर्डम विश्वविद्यालय के एरिक मंडर्स द्वारा बहुत बढ़ा दी गई थी, जिन्होंने पियर्सन उत्पाद-क्षण सहसंबंध गुणांक पेश किया। सूक्ष्मदर्शी के लिए पियर्सन का सहसंबंध गुणांक,[2] अन्य गुणांकों के साथ जिनमें ओवरलैप गुणांक M1 और M2 सबसे लोकप्रिय और उपयोगी साबित हुए हैं।[3][4] गुणांकों का उपयोग करने का उद्देश्य छवियों के बीच ओवरलैप की डिग्री को चिह्नित करना है, आमतौर पर एक बहुआयामी माइक्रोस्कोपी छवि में दो चैनल अलग-अलग उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर दर्ज किए जाते हैं। सिल्वेन कॉस्टेस द्वारा एक लोकप्रिय दृष्टिकोण पेश किया गया था, जिन्होंने पियर्सन के सहसंबंध गुणांक का उपयोग एम 1 और एम 2 के लिए आवश्यक थ्रेसहोल्ड को एक उद्देश्यपूर्ण तरीके से सेट करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया था।[5] कॉस्टेस दृष्टिकोण यह धारणा बनाता है कि केवल सकारात्मक सहसंबंध ही रुचि के हैं, और पीसीसी का उपयोगी माप प्रदान नहीं करता है।

हालांकि गुणांकों के उपयोग से कोलोकलाइज़ेशन का पता लगाने की विश्वसनीयता में काफी सुधार हो सकता है, यह कारकों की संख्या पर निर्भर करता है, जिसमें यह भी शामिल है कि प्रतिदीप्ति के साथ नमूने कैसे तैयार किए गए थे और कैसे कोलोकलाइज़ेशन वाली छवियों को प्राप्त और संसाधित किया गया था। अध्ययनों को बहुत सावधानी के साथ और सावधानीपूर्वक पृष्ठभूमि पढ़ने के बाद आयोजित किया जाना चाहिए। वर्तमान में यह क्षेत्र भ्रम से घिरा हुआ है और एक मानकीकृत दृष्टिकोण अभी तक मजबूती से स्थापित नहीं हुआ है।[6] इसे सुधारने के प्रयासों में पुन: परीक्षा और कुछ गुणांकों का पुनरीक्षण शामिल है,[7][8] शोर के लिए सही करने के लिए एक कारक का अनुप्रयोग,[1] कोलोकलाइज़ेशन के सटीक मापन के लिए रेप्लिकेट आधारित नॉइज़ करेक्टेड सहसंबंध।[9] और आगे के प्रोटोकॉल का प्रस्ताव,[10] जिसकी बोल्ट और कॉर्डेलियर्स (2006) द्वारा गहन समीक्षा की गई थी।[6]इसके अलावा, प्रतिदीप्ति छवियों की एक निश्चित मात्रा में आउट-ऑफ-फोकस सिग्नल, और पॉइसन शॉट और अन्य शोर को शामिल करने की प्रवृत्ति के कारण, उन्हें आमतौर पर परिमाणीकरण से पहले पूर्व-प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है।[11][12] डीकनवोल्यूशन द्वारा सावधानीपूर्वक छवि बहाली शोर को हटा देती है और छवियों में कंट्रास्ट बढ़ाती है, कोलोकलाइज़ेशन विश्लेषण परिणामों की गुणवत्ता में सुधार करती है। अब तक, कोलोकलाइज़ेशन की मात्रा निर्धारित करने के लिए सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली विधियाँ दो अलग-अलग माइक्रोस्कोपी चैनलों में पिक्सेल तीव्रता के सांख्यिकीय सहसंबंध की गणना करती हैं। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि इससे उन लक्ष्यों के लिए भी उच्च सहसंबंध गुणांक हो सकते हैं जो विभिन्न सेलुलर डिब्बों में रहने के लिए जाने जाते हैं।[13] डिजिटल ऑब्जेक्ट रिकग्निशन, क्षेत्र ओवरलैप की गणना और पिक्सेल-तीव्रता सहसंबंध मान के साथ संयोजन करके कोलोकलाइज़ेशन का अधिक मजबूत परिमाणीकरण प्राप्त किया जा सकता है। इसने वस्तु-संशोधित पियर्सन के सहसंबंध गुणांक की अवधारणा को जन्म दिया।[13]


उपयोग के उदाहरण

कुछ अभेद्य फ्लोरोसेंट जिंक रंजक चार अलग-अलग ऊतक प्रकारों में से प्रत्येक के बीच apoptosis और नेक्रोटाइज़िंग कोशिकाओं के साइटोसोल और कोशिका केंद्रक का पता लगा सकते हैं। अर्थात्: सेरेब्रल कॉर्टेक्स, समुद्री घोड़ा , सेरिबैलम, और यह भी प्रदर्शित किया गया था कि जस्ता वृद्धि के कोलोकलाइज्ड डिटेक्शन और अच्छी तरह से स्वीकृत सेल डेथ इंडिकेटर प्रोपीडियम आयोडाइड भी गुर्दे की कोशिकाओं में हुआ। फ्लोरोसेंट कोलोकलाइज़ेशन के सिद्धांतों का उपयोग करना। कई प्रकार की कोशिकाओं में जस्ता संचय और प्रोपीडियम आयोडाइड (एक पारंपरिक कोशिका मृत्यु सूचक) के संयोग का पता लगाने का प्रदर्शन किया गया।[14] तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में कोलोकलाइज़ेशन के परिमाणीकरण के विभिन्न उदाहरण एक समीक्षा में पाए जा सकते हैं।[15] कोलोकलाइज़ेशन की मात्रा का विस्तृत प्रोटोकॉल एक पुस्तक अध्याय में पाया जा सकता है।[16]


एकल-अणु संकल्प

कोलोकलाइज़ेशन का उपयोग वास्तविक समय के एकल-अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में किया जाता है ताकि फ्लोरोसेंटली लेबल वाली आणविक प्रजातियों के बीच परस्पर क्रियाओं का पता लगाया जा सके। इस मामले में, एक प्रजाति (जैसे एक डीएनए अणु) आमतौर पर इमेजिंग सतह पर स्थिर होती है, और अन्य प्रजातियों (जैसे डीएनए-बाध्यकारी प्रोटीन) को समाधान के लिए आपूर्ति की जाती है। दो प्रजातियों को वर्णक्रमीय रूप से हल (>50 एनएम) रंगों के रंगों के साथ लेबल किया जाता है, उदा। साइनाइन-3 और साइनाइन-5। फ्लोरेसेंस उत्तेजना आमतौर पर कुल आंतरिक प्रतिबिंब मोड में किया जाता है जो थोक समाधान में अणुओं के संबंध में सतह पर अणुओं के लिए सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाता है। अणुओं का वास्तविक समय में सतह पर दिखने वाले धब्बों के रूप में पता लगाया जाता है, और उनके स्थान बिंदु-प्रसार कार्यों की फिटिंग द्वारा 10-20 एनएम के भीतर पाए जाते हैं। चूंकि जैव-अणुओं के विशिष्ट आकार 10 एनएम के क्रम में होते हैं, इसलिए यह सटीकता आमतौर पर आणविक अंतःक्रियाओं को बुलाने के लिए पर्याप्त होती है [17]


परिणामों की व्याख्या

गुणात्मक और मात्रात्मक कोलोकलाइज़ेशन अध्ययन के परिणामों की बेहतर व्याख्या के उद्देश्य से, कोलोकलाइज़ेशन गुणांक के मूल्यों से बंधे पांच भाषाई चर के एक सेट का उपयोग करने का सुझाव दिया गया था, जैसे बहुत कमजोर, कमजोर, मध्यम, मजबूत और बहुत मजबूत, उनका वर्णन करने के लिए। दृष्टिकोण फ़ज़ी सिस्टम मॉडल और कंप्यूटर सिमुलेशन के उपयोग पर आधारित है। जब नए गुणांक पेश किए जाते हैं, तो उनके मान सेट में फिट किए जा सकते हैं।[18]


संबंधित तकनीकें

  • फोरस्टर रेजोनेंस एनर्जी ट्रांसफर (FRET): 10 एनएम निकटता
  • इम्यूनो वर्षा (आईपी) ड्रॉपडाउन / पुलडाउन
  • यीस्ट 2 हाइब्रिड - प्रोटीन इंटरेक्शन मैपिंग

बेंचमार्क छवियां

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों में कोलोकलाइज़ेशन की डिग्री को कोलोकलाइज़ेशन बेंचमार्क स्रोत का उपयोग करके मान्य किया जा सकता है, जो कोलोकलाइज़ेशन के पूर्व-निर्धारित मूल्यों के साथ डाउनलोड करने योग्य छवि सेट का एक मुफ्त संग्रह है।

सॉफ्टवेयर कार्यान्वयन

ओपन सोर्स

  • फिजी सिर्फ ImageJ है - बैटरी शामिल है
  • बायोइमेज एक्सडी

बंद स्रोत

  • AxioVision कोलोकलाइज़ेशन मॉड्यूल
  • कोलोकलाइजेशन रिसर्च सॉफ्टवेयर
  • CoLocalizer प्रो CoLocalizer प्रो
  • निकॉन का एनआईएस-एलिमेंट्स कोलोकलाइज़ेशन मॉड्यूल
  • साइंटिफिक वॉल्यूम इमेजिंग का ह्यूजेंस कोलोकलाइजेशन एनालाइजर
  • कोरम प्रौद्योगिकी की गति
  • मीडिया साइबरनेटिक्स इमेज-प्रो
  • बिटप्लेन की इमरिस
  • अरिविस विजन4डी
  • [19]


संदर्भ

  1. ↑ 1.0 1.1 Adler et al. (2008)
  2. ↑ Manders et al (1992). "Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy." [1]
  3. ↑ Manders; et al. (1993). "दोहरे रंग की कॉन्फोकल छवियों में वस्तुओं के सह-स्थानीयकरण का मापन". Journal of Microscopy. 169 (3): 375–382. doi:10.1111/j.1365-2818.1993.tb03313.x. PMID 33930978. S2CID 95098323.
  4. ↑ Zinchuk V et al (2007). "Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena". Acta Histochem Cytochem 40:101-111.
  5. ↑ Costes et al (2004) "Automatic and Quantitative Measurement of Protein-Protein Colocalization in Live Cells." [2]
  6. ↑ 6.0 6.1 BOLTE and CORDELIÈRES (2006) "A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy." [3]
  7. ↑ Adler and Parmryd (2010)"Quantifying colocalization by correlation: The Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient." [4]
  8. ↑ Krauß et al (2015). "Colocalization of fluorescence and Raman microscopic images for the identification of subcellular compartments: a validation study." Analyst, volume 140, issue 7, pages 2360-2368. [5]
  9. ↑ Adler, J.; Pagakis, S. N.; Parmryd, I. (1 April 2008). "कोलोकलाइज़ेशन के सटीक मापन के लिए रेप्लिकेट-आधारित नॉइज़ करेक्टेड कोरिलेशन". Journal of Microscopy. 230 (1): 121–133. doi:10.1111/j.1365-2818.2008.01967.x. PMID 18387047. S2CID 12758752.
  10. ↑ Curr Protoc Cell Biol "Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images." Archived 2009-11-28 at the Wayback Machine
  11. ↑ Pawley JB (2006). Handbook of Biological Confocal Microscopy
  12. ↑ Zinchuk V et al (2011). "Quantifying spatial correlations of fluorescent markers using enhanced background reduction with protein proximity index and correlation coefficient estimations". Nat Protoc 6:1554-1567.
  13. ↑ 13.0 13.1 Moser, Bernhard; Hochreiter, Bernhard; Herbst, Ruth; Schmid, Johannes A. (2016-07-01). "पिक्सेल-तीव्रता-सहसंबंध के साथ वस्तु-मान्यता को जोड़कर प्रतिदीप्ति कोलोकलाइज़ेशन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण में सुधार किया जा सकता है". Biotechnology Journal (in English). 12 (1): 1600332. doi:10.1002/biot.201600332. ISSN 1860-7314. PMC 5244660. PMID 27420480.
  14. ↑ Stork, Christian J.; Li, Yang V. (15 September 2006). "झिल्ली अभेद्य जस्ता फ्लोरोसेंट संकेतक के साथ सेल व्यवहार्यता को मापना". Journal of Neuroscience Methods. 155 (2): 180–186. doi:10.1016/j.jneumeth.2005.12.029. PMID 16466804. S2CID 16900662.
  15. ↑ Zinchuk V & Grossenbacher-Zinchuk O (2009). "Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience". Prog Histochem Cytochem 44:125-172
  16. ↑ "Adler J & Parmryd I (2013) Methods Mol Biol 931, 97-109". Colocalization analysis in fluorescence microscopy. Retrieved 2016-04-19.
  17. ↑ Gelles, Friedman L. (17 February 2012). "एकल-अणु अवलोकन द्वारा परिभाषित एक एक्टिवेटर-डिपेंडेंट प्रमोटर पर ट्रांसक्रिप्शन दीक्षा का तंत्र". Cell. 148 (4): 635–637. doi:10.1016/j.cell.2012.01.018. PMC 3479156. PMID 22341441.
  18. ↑ Zinchuk, V; et al. (2013). "प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी अध्ययन में गुणात्मक और मात्रात्मक सहस्थानीयकरण के बीच की खाई को पाटना". Sci Rep. 3: 1365. doi:10.1038/srep01365. PMC 3586700. PMID 23455567.
  19. ↑ Rewire Neuro's Pipsqueak Pro
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