सूक्षमस्फटिक इलेक्ट्रॉन विवर्तन

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माइक्रोक्रिस्टल इलेक्ट्रॉन विवर्तन, या माइक्रोईडी,[1][2] एक क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विधि है जिसे 2013 के अंत में हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट के जेनेलिया रिसर्च कैंपस में मरम्मत चला गया प्रयोगशाला द्वारा विकसित किया गया था। माइक्रोईडी इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी का एक रूप है जहां इलेक्ट्रॉन विवर्तन द्वारा संरचना निर्धारण के लिए पतले 3डी क्रिस्टल का उपयोग किया जाता है। इस प्रदर्शन से पहले, मैक्रोमोलेक्यूलर (प्रोटीन) इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी का उपयोग केवल 2डी क्रिस्टल पर किया जाता था, उदाहरण के लिए।[3][4] विधि को nanocrystal से प्रोटीन संरचना के लिए विकसित किया गया था जो आमतौर पर उनके आकार के कारण एक्स-रे विवर्तन के लिए उपयुक्त नहीं होते हैं।[5] एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए आवश्यक आकार के एक अरबवें हिस्से के क्रिस्टल उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त कर सकते हैं।[6] नमूने अन्य सभी क्रायोईएम तौर-तरीकों के लिए हाइड्रेटेड हैं, लेकिन इमेजिंग मोड में ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन क्रायोमाइक्रोस्कोपी) का उपयोग करने के बजाय एक अत्यंत कम इलेक्ट्रॉन जोखिम (आमतौर पर <0.01 ई) के साथ विवर्तन मोड में इसका उपयोग करता है।−/Å2/से)। नैनो क्रिस्टल विवर्तक किरण के संपर्क में आता है और लगातार घूमता रहता है[2]जबकि फिल्म के रूप में एक तेज कैमरे पर विवर्तन एकत्र किया जाता है।[2]संरचना विश्लेषण और शोधन के लिए विशेष सॉफ़्टवेयर की आवश्यकता के बिना एक्स - रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए पारंपरिक सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके माइक्रोएड डेटा को संसाधित किया जाता है।[7] महत्वपूर्ण रूप से, माइक्रोएड प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर दोनों मानक और मोटे तौर पर उपलब्ध हैं।[8]<re f चाटना = नानेंगा 369-379>Nannenga, Brent L.; Gonen, Tamir (May 2019). "क्रायो-ईएम विधि माइक्रोक्रिस्टल इलेक्ट्रॉन विवर्तन (माइक्रोईडी)". Nature Methods (in English). 16 (5): 369–379. doi:10.1038/s41592-019-0395-x. ISSN 1548-7091.</ref>

विकास

माइक्रोएड का पहला सफल प्रदर्शन 2013 में तामीर गोनन प्रयोगशाला द्वारा रिपोर्ट किया गया था।[1] लाइसोजाइम की संरचना, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी में एक क्लासिक परीक्षण प्रोटीन। यह पहली बार था कि इलेक्ट्रॉन विवर्तन का उपयोग करके 3डी क्रिस्टल से प्रोटीन संरचना निर्धारित की गई थी। अब्राहम समूह ने स्वतंत्र रूप से लाइसोजाइम क्रिस्टल पर मेडिपिक्स क्वांटम एरिया डिटेक्टर का उपयोग करके रोटेशन इलेक्ट्रॉन विवर्तन डेटा संग्रह एकत्र करने की सूचना दी लेकिन संरचना को हल करने में असमर्थ थे।[9]


प्रायोगिक सेटअप

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप की स्थापना और डेटा संग्रह के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गए हैं।[10]


इंस्ट्रूमेंटेशन

सूक्ष्मदर्शी

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन क्रायोमिक्रोस्कोपी | ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन (क्रायोजेनिक) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके माइक्रोईडी डेटा एकत्र किया जाता है। माइक्रोस्कोप को एक चयनित क्षेत्र एपर्चर से लैस किया जा सकता है लेकिन माइक्रोएड को चयनित क्षेत्र एपर्चर के बिना भी किया जा सकता है। जबकि कुछ संरचनाओं को ठंड के बिना सूचित किया गया है, विकिरण क्षति को बहुत कम किया गया है और छोटे अणुओं के लिए भी क्रायो कूलिंग का उपयोग करके उच्च रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया गया है।[11]


डिटेक्टर

माइक्रोईडी प्रयोगों में इलेक्ट्रॉन विवर्तन डेटा एकत्र करने के लिए विभिन्न प्रकार के डिटेक्टरों का उपयोग किया गया है। चार्ज-युग्मित डिवाइस | चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) और सीएमओएस | पूरक धातु-ऑक्साइड-सेमीकंडक्टर (सीएमओएस) तकनीक का उपयोग करने वाले डिटेक्टरों का उपयोग किया गया है। CMOS डिटेक्टरों के साथ, अलग-अलग इलेक्ट्रॉन गणनाओं की व्याख्या की जा सकती है।[12] हाल ही में, रैखिक और गिनती मोड दोनों में प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है।[13][14] इन उदाहरणों में इलेक्ट्रॉन की गणना ने प्रोटीन में हाइड्रोजन के प्रारंभिक चरणबद्धता और विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति दी।

डेटा संग्रह

अभी भी विवर्तन

माइक्रोईडी पर अवधारणा प्रकाशन का प्रारंभिक प्रमाण लाइसोजाइम क्रिस्टल का उपयोग करता है।[1]फ़्रेमों के बीच असतत 1 डिग्री चरणों के साथ, एकल नैनो क्रिस्टल से 90 डिग्री तक डेटा एकत्र किया गया था। प्रत्येक विवर्तन पैटर्न को-0.01 ई की अति-निम्न खुराक दर के साथ एकत्र किया गया था−/Å2/से. 3 क्रिस्टल से डेटा मर्ज किया गया था[15] अच्छे शोधन आँकड़ों के साथ 2.9Å रिज़ॉल्यूशन संरचना प्राप्त करने के लिए, और पहली बार प्रतिनिधित्व किया[15]क्रायोजेनिक स्थितियों में 3डी माइक्रोक्रिस्टल से खुराक के प्रति संवेदनशील प्रोटीन की संरचना का निर्धारण करने के लिए इलेक्ट्रॉन विवर्तन का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया था।

निरंतर चरण रोटेशन

डेटा संग्रह योजना के दौरान निरंतर रोटेशन लागू करके सिद्धांत पेपर के सबूत के तुरंत बाद माइक्रोईडी में सुधार किया गया था।[2]यहां क्रिस्टल को धीरे-धीरे एक ही दिशा में घुमाया जाता है जबकि विवर्तन को तेज कैमरे पर मूवी के रूप में रिकॉर्ड किया जाता है। कार्यप्रणाली एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी में रोटेशन विधि की तरह है। इससे डेटा गुणवत्ता में कई सुधार हुए और मानक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफिक सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा प्रोसेसिंग की अनुमति मिली।[2]निरंतर रोटेशन के लाभों में माइक्रोईडी में गतिशील बिखरने में कमी शामिल है[16] और पारस्परिक स्थान का बेहतर नमूनाकरण। 2014 से निरंतर-रोटेशन माइक्रोईडी डेटा संग्रह का मानक तरीका है।

डाटा प्रोसेसिंग

माइक्रोईडी डाटा प्रोसेसिंग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गए हैं।[7] जब निरंतर चरण रोटेशन का उपयोग करके माइक्रोईडी डेटा एकत्र किया जाता है, तो मानक :श्रेणी:क्रिस्टलोग्राफी सॉफ्टवेयर<रेफरी नाम= नन्नेंगा 369–379 /> का उपयोग किया जा सकता है।

माइक्रोईडी और अन्य इलेक्ट्रॉन विवर्तन विधियों के बीच अंतर

अकार्बनिक लवण जैसे विकिरण असंवेदनशील सामग्री के भौतिक विज्ञान के लिए विकसित अन्य इलेक्ट्रॉन विवर्तन विधियों में स्वचालित विवर्तन टोमोग्राफी (ADT) शामिल हैं।[17] और रोटेशन इलेक्ट्रॉन विवर्तन (लाल[18]). ये विधियां माइक्रोईडी से काफी भिन्न हैं: एडीटी में गोनियोमीटर झुकाव के असतत चरणों का उपयोग अंतराल को भरने के लिए बीम पुरस्सरण के संयोजन में पारस्परिक स्थान को कवर करने के लिए किया जाता है।[17]ADT क्रिस्टल ट्रैकिंग के लिए प्रीसेशन और स्कैनिंग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए विशेष हार्डवेयर का उपयोग करता है।[17]रेड टीईएम में किया जाता है लेकिन गोनियोमीटर असतत चरणों में मोटे तौर पर झुका हुआ होता है और अंतराल को भरने के लिए बीम टिल्टिंग का उपयोग किया जाता है।[18]ADT और RED डेटा को प्रोसेस करने के लिए विशेष सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया जाता है।[18]महत्वपूर्ण रूप से, ADT और RED को विकिरण असंवेदनशील अकार्बनिक सामग्री और लवणों पर विकसित और परीक्षण किया गया था और जमे हुए हाइड्रेटेड अवस्था में अध्ययन किए गए प्रोटीन या विकिरण संवेदनशील कार्बनिक पदार्थों के साथ उपयोग के लिए प्रदर्शित नहीं किया गया है।

मील के पत्थर

विधि गुंजाइश

बड़े गोलाकार प्रोटीन की संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए माइक्रोईडी का उपयोग किया गया है,[19] छोटे प्रोटीन,[2]पेप्टाइड्स,[20]झिल्ली प्रोटीन,[21] कार्बनिक अणु,[22][23] और अकार्बनिक यौगिक।[24] इनमें से कई उदाहरणों में हाइड्रोजन और आवेशित आयन देखे गए।[20][21]


पार्किंसंस रोग के α-सिन्यूक्लिन की नवीन संरचना

माइक्रोईडी द्वारा हल की गई पहली उपन्यास संरचनाएं 2015 के अंत में प्रकाशित हुई थीं।[20] ये संरचनाएं पेप्टाइड अंशों की थीं जो पार्किंसंस रोग के लिए जिम्मेदार प्रोटीन अल्फा-सिंक्यूक्लिन|α-सिंक्युलिन के विषाक्त कोर का निर्माण करती हैं और एकत्रीकरण तंत्र विषाक्त समुच्चय में अंतर्दृष्टि का नेतृत्व करती हैं। संरचनाओं को 1.4 Å रिज़ॉल्यूशन पर हल किया गया था।

=== R2lox === की नई प्रोटीन संरचना

MicroED द्वारा हल की गई प्रोटीन की पहली उपन्यास संरचना 2019 में प्रकाशित हुई थी।[25] प्रोटीन सल्फ़ोलोबस एसिडोकैल्डेरियस से मेटालोएंजाइम आर2-लाइक लिगैंड-बाइंडिंग ऑक्सीडेज (आर2लोक्स) है। ज्ञात संरचना के साथ निकटतम होमोलॉग से निर्मित 35% अनुक्रम पहचान के मॉडल का उपयोग करके आणविक प्रतिस्थापन द्वारा संरचना को 3.0 Å रिज़ॉल्यूशन पर हल किया गया था। इस काम ने प्रदर्शित किया कि प्रोटीन की अज्ञात संरचना प्राप्त करने के लिए माइक्रोईडी का उपयोग किया जा सकता है।

माइक्रोएड शिक्षा और सेवाओं तक पहुंच

MicroED के बारे में अधिक जानने के लिए, कोई वार्षिक MicroED Imaging Center Course at UCLA या [1] में भाग ले सकता है। -इमेजिंग/ईबीआईसी/ट्रेनिंग/कोर्स-टाइटल-पीजी/माइक्रो-एड-कोर्स.एचटीएमएल डायमंड लाइट सोर्स पर माइक्रोईडी कोर्स]। क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विधियों से संबंधित आगामी बैठकों और कार्यशालाओं के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया 3DEM बैठकें और कार्यशालाएं पृष्ठ देखें।

कई विश्वविद्यालय और कंपनियां माइक्रोईडी सेवाएं प्रदान करती हैं, जिनमें MEDIC - UCLA में माइक्रोक्रिस्टल इलेक्ट्रॉन डिफ्रैक्शन इमेजिंग सेंटर और नैनोइमेजिंग शामिल हैं सेवाएं।

कई इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप सिस्टम माइक्रोएड डेटा रिकॉर्ड करने में सक्षम हैं जिनमें जेईओएल द्वारा विकसित डेटा शामिल हैं; और थर्मो फिशर/एफईआई।

संदर्भ

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