होचस्ट अभिरंजक: Difference between revisions
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होचस्ट अभिरंजक अभिरंजक डीएनए द्वारा जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले नीले फ्लोरोसेंट रंजकों के एक समूह का भाग हैं।[1][2] ये बीआईएस-बेंजिमाइड्स मूल रूप से होचस्ट एजी द्वारा विकसित किए गए थे, जिन्होंने अपने सभी यौगिकों को क्रमांकित किया था जिससे रंजक होचस्ट 33342 कंपनी द्वारा बनाया गया 33,342 वां यौगिक हो। होचस्ट से संबंधित तीन अभिरंजक हैं: होचस्ट 33258, होचस्ट 33342, और होचस्ट 34580। होचस्ट 33258 और होचस्ट 33342 सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले रंजक हैं और उनके समान उत्तेजना -उत्सर्जन वर्णक्रम हैं।
आणविक विशेषताएँ
दोनों रंग लगभग 350 नैनोमीटर(एनएम) पर पराबैंगनी प्रकाश से उत्तेजित होते हैं, और दोनों 461 एनएम पर अधिकतम उत्सर्जन वर्णक्रम के आसपास नीले-सियान प्रतिदीप्ति प्रकाश का उत्सर्जन करते हैं। अबाध(अबाध) रंजक का अधिकतम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन 510-540 एनएम रेंज में होता है। होचस्ट के अभिरंजक एक जेनॉन-चाप दीपक(जेनॉन-आर्क लैम्प) या पारा-चाप दीपक (मरकरी-आर्क लैम्प) या एक पराबैंगनी लेज़र के साथ उत्तेजित हो सकते हैं। उत्तेजना और उत्सर्जन वर्णक्रम के बीच अधिक 'स्टोक्स बदलाव' है जो होचस्ट रंजकों को उन प्रयोगों में उपयोगी बनाता है जिनमें कई फ्लोरोफोरेस का उपयोग किया जाता है। विलायक के पीएच के साथ होचस्ट रंजकों की प्रतिदीप्ति तीव्रता भी बढ़ जाती है।[3]
होचस्ट रंजक पानी में और कार्बनिक विलायकों जैसे डाइमिथाइल फॉर्मामाइड या डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड में घुलनशील होते हैं। इस प्रकार 10 मिलीग्राम/एमएल(10 mg/mL) तक सांद्रता प्राप्त की जा सकती है। प्रकाश से सुरक्षित होने पर जलीय घोल कम से कम छह महीने के लिए 2–6 डिग्री कोशिका्सियस पर स्थिर रहता है। लंबी अवधि के भंडारण के लिए विलायक -20 डिग्री कोशिका्सियस अथवा उससे कम पर स्थिर रहते हैं।[3]
रंजक एडीनाइन और थाइमिन से भरपूर दृश्यों के लिए वरीयता के साथ द्विस्तरीय डीएनए के सामान्य खांचे से बंधते हैं। चूंकि रंजक सभी न्यूक्लिक एसिड से बंध सकते हैं, अतः एटी-रिच द्विस्तरीय डीएनए के प्रकार प्रतिदीप्ति को अधिक बढ़ाते हैं।[4] होचस्ट रंजक कोशिका-पारगम्य हैं और जीवित या निश्चित कोशिकाओं में डीएनए को बांध सकते हैं। इस प्रकार, इन अभिरंजकों को प्रायः सुप्राविटल कहा जाता है, जिसका अर्थ है कि जीवित कोशिकाएं इन यौगिकों के साथ उपचार से बच जाती हैं। कोशिकाएं जो विशिष्ट एटीपी-बाध्यकारी कैसेट परिवाहक प्रोटीन को व्यक्त करती हैं, वे इन अभिरंजकों को अपने कोशिका द्रव्य से सक्रिय रूप से परिवहन कर सकती हैं।
अनुप्रयोग
जीवाणु या यूकेरियोट कोशिकाओं में डीएनए को अभिरंजन के लिए सामान्यतः 0.1–12 μg/ml की सांद्रता का उपयोग किया जाता है। कोशिकाओं को कक्षीय तापमान या 37 डिग्री कोशिका्सियस पर 1-30 मिनट के लिए अभिरंजक दिया जाता है और फिर अबाध रंजक को हटाने के लिए धोया जाता है। अबाध होचस्ट रंजक का एक हरा प्रतिदीप्ति उन प्रतिरूपों पर देखा जा सकता है जो बहुत अधिक रंजक से अभिरंजित किये गए हैं या जो आंशिक रूप से धोए गए हैं।[3] होचस्ट रंजक प्रायः डीएपीआई नामक एक अन्य न्यूक्लिक एसिड अभिरंजक के विकल्प के रूप में उपयोग किए जाते हैं।
होचस्ट रंजक और डीएपीआई के बीच मुख्य अंतर हैं:
- होचस्ट रंजक डीएपीआई की तुलना में कम विषैले होते हैं, जो अभिरंजकदार कोशिकाओं की उच्च व्यवहार्यता सुनिश्चित करते हैं।[5]
- कुछ होचस्ट रंजकों (होचस्ट 33342) में अतिरिक्त एथिल समूह होने के कारण उन्हें अधिक कोशिका-पारगम्य बनाता है।[6]
- ये नाभिकीय स्टेनिंग रंजक हैं जो स्टेनिंग के बाद कोशिकाओं की व्यवहार्यता की अनुमति देते हैं।
होचस्ट 33342 और 33258 ब्रोमोडॉक्सीयूरिडीन (ब्रोमोडॉक्सीयूरिडीन) द्वारा प्रतिदीप्ति हैं, जो सामान्यतः विभाजित कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है। होचस्ट 33342 , H 33258 की तुलना में 10 गुना अधिक कोशिका-पारगम्यता प्रदर्शित करता है। कोशिका नए संश्लेषित डीएनए में थाइमिडीन के विकल्प के रूप में ब्रोमोडॉक्सीयूरिडीन को एकीकृत कर सकते हैं। जब ब्रोमोडॉक्सीयूरिडीन को डीएनए में एकीकृत किया जाता है, तो यह माना जाता है कि ब्रोमिन सामान्य खांचे को विकृत कर देता है जिससे होचस्ट रंजक अपने इष्टतम बंधन स्थल तक नहीं पहुंच सके। होचस्ट रंजकों की बाइंडिंग ब्रोमोडॉक्सीयूरिडीन-प्रतिस्थापित डीएनए से भी शक्तिशाली है; यद्यपि, कोई प्रतिदीप्ति नहीं होती है। कोशिका चक्र की प्रगति की निगरानी के लिए होचस्ट रंजकों का उपयोग ब्रोमोडॉक्सीयूरिडीन के साथ किया जा सकता है।[7][8]
निम्नलिखित अनुप्रयोगों में जीनोमिक डीएनए को अभिरंजन के लिए सामान्यतः होचस्ट रंजक का उपयोग किया जाता है:
- प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री, प्रायः अन्य फ्लोरोफोरस के साथ है[9]
- कोशिकाओं को गिनने या छाँटने के लिए फ़्लो साइटॉमेट्री(कोशिका चक्र विश्लेषण) के किस चरण में जनसंख्या की कितनी कोशिकाएं हैं, इसका विश्लेषण करने के लिए होचस्ट रंजकों का उपयोग एक उदाहरण है।[10]
- एग्रोस जेल वैद्युत-कण-संचलन में आरएनए की उपस्थिति में डीएनए का पता लगाना है[11]
- स्वचालित डीएनए निर्धारण[12]
- गुणसूत्र श्रेणीकरण[11]
होचस्ट बहिःस्त्राव का उपयोग हेमेटोपोएटिक और भ्रूण स्टेम कोशिका का अध्ययन करने के लिए भी किया जाता है। चूँकि ये कोशिकाएँ रंजक को प्रभावी ढंग से प्रवाहित करने में सक्षम होती हैं, उन्हें फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से पता लगाया जा सकता है जिसे पक्ष-जनसंख्या कहा जाता है। यह लाल और नीले दोनों फिल्टर के माध्यम से उत्तेजित होचस्ट से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति को पारित करके और एक दूसरे के विपरीत लाल और नीले रंग की षड्यंत्र रचने के द्वारा किया जाता है।[citation needed]
विषाक्तता और सुरक्षा
क्योंकि होचस्ट के अभिरंजक डीएनए से जुड़ते हैं, इसलिए वे कोशिका विभाजन के समय डीएनए प्रतिकृति में हस्तक्षेप करते हैं। परिणाम स्वरुप, वे संभावित रूप से उत्परिवर्तनीय और कारसीनोजेनिक हैं, इसलिए उनके प्रबंधन और निराकरण में सावधानी बरती जानी चाहिए। होचस्ट अभिरंजक का उपयोग पशुधन और मनुष्यों में शुक्राणु प्रथककरण के लिए किया जाता है। इसकी सुरक्षा पर वाद-विवाद हुआ है।[13][14]
यह भी देखें
- बिस्बेंज़िमाइड
- कार्सिनोजेन
- डीएपीआई
- डीएनए-बाध्यकारी प्रोटीन
- उत्साहित राज्य
- प्रतिदीप्ति
- प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
- फ्लोरोफोर
- फ़्लो साइटॉमेट्री
- होचस्ट एजी
- इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
- लेक्सिट्रोप्सिन
- मामूली नाली
- मुटाजेन
- नेट्रोप्सिन
- न्यूक्लिक एसिड सिमुलेशन सॉफ्टवेयर की तुलना
- पेंटामिडाइन
- शमन (प्रतिदीप्ति)
- स्टोक्स पारी
संदर्भ
- ↑ Latt, SA; Stetten, G; Juergens, LA; Willard, HF; Scher, CD (July 1975). "Recent developments in the detection of deoxyribonucleic acid synthesis by 33258 Hoechst fluorescence". Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 23 (7): 493–505. doi:10.1177/23.7.1095650. PMID 1095650.
- ↑ Latt, SA; Stetten, G (January 1976). "Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis". Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 24 (1): 24–33. doi:10.1177/24.1.943439. PMID 943439.
- ↑ 3.0 3.1 3.2 "Hoechst Stains" (PDF). Invitrogren (Molecular Probes). Archived from the original (PDF) on 2009-04-19.
- ↑ Portugal, J; Waring, MJ (Feb 28, 1988). "Assignment of DNA binding sites for 4′,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 949 (2): 158–68. doi:10.1016/0167-4781(88)90079-6. PMID 2449244.
- ↑ BD Bioscience (2009). Techniques for Immune Function Analysis (PDF) (2 ed.). Becton, Dickinson and Company.
- ↑ Bucevičius, Jonas; Lukinavičius, Gražvydas; Gerasimaitė, Rūta (2018-04-18). "The Use of Hoechst Dyes for DNA Staining and beyond". Chemosensors (in English). 6 (2): 18. doi:10.3390/chemosensors6020018. ISSN 2227-9040.
- ↑ Kubbies, M; Rabinovitch, PS (January 1983). "Flow cytometric analysis of factors which influence the BrdUrd-Hoechst quenching effect in cultivated human fibroblasts and lymphocytes". Cytometry. 3 (4): 276–81. doi:10.1002/cyto.990030408. PMID 6185287.
- ↑ Breusegem, SY; Clegg, RM; Loontiens, FG (Feb 1, 2002). "Base-sequence specificity of Hoechst 33258 and DAPI binding to five (A/T)4 DNA sites with kinetic evidence for more than one high-affinity Hoechst 33258-AATT complex". Journal of Molecular Biology. 315 (5): 1049–61. doi:10.1006/jmbi.2001.5301. PMID 11827475.
- ↑ Iain Johnson, Michelle T.Z. Spence, ed. (2011). Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies (11 ed.). Invitrogen. ISBN 978-0-9829279-1-5.
- ↑ Kubbies, M (1990). "Flow cytometric recognition of clastogen induced chromatin damage in G0/G1 lymphocytes by non-stoichiometric Hoechst fluorochrome binding". Cytometry. 11 (3): 386–94. doi:10.1002/cyto.990110309. PMID 1692786.
- ↑ 11.0 11.1 Mocharla, R; Mocharla, H; Hodes, ME (Dec 23, 1987). "A novel, sensitive fluorometric staining technique for the detection of DNA in RNA preparations". Nucleic Acids Research. 15 (24): 10589. doi:10.1093/nar/15.24.10589. PMC 339970. PMID 2447564.
- ↑ Sterzel, W; Bedford, P; Eisenbrand, G (June 1985). "Automated determination of DNA using the fluorochrome Hoechst 33258". Analytical Biochemistry. 147 (2): 462–7. doi:10.1016/0003-2697(85)90299-4. PMID 2409841.
- ↑ Ashwood-Smith, M.J. (1994). "Safety of human sperm selection by flow cytometry". Human Reproduction. Oxford University Press. 9 (5): 757–759. doi:10.1093/oxfordjournals.humrep.a138589. PMID 7929716.
- ↑ Parrilla, I; Vázquez, J M; Cuello, C; Gil, MA; Roca, J; Di Berardino, D; Martínez, EA (2004). "Hoechst 33342 stain and u.v. laser exposure do not induce genotoxic effects in flow-sorted boar spermatozoa". Reproduction. 128 (5): 615–621. doi:10.1530/rep.1.00288. PMID 15509707.
