होचस्ट अभिरंजक

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होचस्ट रंगों की रासायनिक संरचना

होचस्ट दाग डीएनए (जीव विज्ञान) को धुंधला करने के लिए उपयोग किए जाने वाले नीले फ्लोरोसेंट रंगों के एक परिवार का हिस्सा हैं।[1][2] ये बिस्बेनज़िमाइड्स | बीआईएस-बेंजिमाइड्स मूल रूप से होचस्ट एजी द्वारा विकसित किए गए थे, जिन्होंने अपने सभी यौगिकों को क्रमांकित किया था ताकि डाई होचस्ट 33342 कंपनी द्वारा बनाया गया 33,342 वां यौगिक हो। होचस्ट से संबंधित तीन दाग हैं: होचस्ट 33258, होचस्ट 33342, और होचस्ट 34580। डाई होचस्ट 33258 और होचस्ट 33342 सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले हैं और उनके समान उत्साहित राज्य-उत्सर्जन स्पेक्ट्रम हैं।

आणविक विशेषताएँ

होचस्ट रंगों का उत्तेजना-उत्सर्जन स्पेक्ट्रा

दोनों रंग लगभग 350 नैनोमीटर पर पराबैंगनी प्रकाश से उत्तेजित होते हैं, और दोनों 461 एनएम पर अधिकतम उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के आसपास नीले-सियान प्रतिदीप्ति प्रकाश का उत्सर्जन करते हैं। अनबाउंड डाई का अधिकतम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन 510-540 एनएम रेंज में होता है। होचस्ट के दाग एक क्सीनन चाप दीपक|क्सीनन- या पारा-वाष्प दीपक|मरकरी-आर्क लैम्प या एक पराबैंगनी लेज़र के साथ उत्तेजित हो सकते हैं। उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के बीच काफी स्टोक्स बदलाव है जो होचस्ट रंगों को उन प्रयोगों में उपयोगी बनाता है जिनमें कई फ्लोरोफोरेस का उपयोग किया जाता है। विलायक के पीएच के साथ होचस्ट रंगों की प्रतिदीप्ति तीव्रता भी बढ़ जाती है।[3]

होचस्ट रंजक पानी में और कार्बनिक सॉल्वैंट्स जैसे डाइमिथाइल फॉर्मामाइड या डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड में घुलनशील होते हैं। 10 मिलीग्राम/एमएल तक सांद्रता प्राप्त की जा सकती है। प्रकाश से सुरक्षित होने पर जलीय घोल कम से कम छह महीने के लिए 2–6 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रहता है। लंबी अवधि के भंडारण के लिए समाधान -20 डिग्री सेल्सियस या उससे कम पर जमे हुए हैं।[3]

Hoechst 33258 (मैजेंटा) डीएनए (हरा और नीला) के मामूली खांचे से जुड़ा हुआ है। से PDB: 264D​.

रंजक एडीनाइन और थाइमिन से भरपूर दृश्यों के लिए वरीयता के साथ डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए के मामूली खांचे से बंधते हैं। हालांकि रंजक सभी न्यूक्लिक एसिड से बंध सकते हैं, एटी-रिच डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए स्ट्रैंड्स प्रतिदीप्ति को काफी बढ़ाते हैं।[4] Hoechst रंजक कोशिका-अर्धपारगम्य झिल्ली हैं और लाइव या निर्धारण (ऊतक विज्ञान) में डीएनए को बांध सकते हैं। इस प्रकार, इन दागों को अक्सर सुप्राविटल धुंधला कहा जाता है, जिसका अर्थ है कि जीवित कोशिकाएं इन यौगिकों के साथ उपचार से बच जाती हैं। कोशिकाएं जो विशिष्ट एटीपी-बाध्यकारी कैसेट ट्रांसपोर्टर प्रोटीन को व्यक्त करती हैं, वे इन दागों को अपने कोशिका द्रव्य से सक्रिय रूप से परिवहन कर सकती हैं।[citation needed]


अनुप्रयोग

होचस्ट 33258 स्टेनिंग (नीला) के ओवरले के साथ पूरा कोशिकाओं की संचरण छवि। बाईं ओर की कोशिका पिंजरे का बँटवारा के prometaphase चरण में है; इसके गुणसूत्र चमकीले रूप से प्रतिदीप्त होते हैं क्योंकि उनमें अत्यधिक संकुचित डीएनए होता है।
अल्जाइमर रोग के साथ मानव के शिरापरक रक्त से पृथक खेती न्यूट्रोफिल की प्रतिदीप्त छवि। नमूने को होचस्ट 33342 डाई से उपचारित किया गया जिसका उपयोग डीएनए को दागने के लिए किया जाता है। चित्र दृश्य क्षेत्र के केंद्र में एक न्यूट्रोफिल द्वारा डीएनए की रिहाई को दर्शाता है जो एडी रोगियों में न्युट्रोफिल बाह्यकोशिकीय जाल के सहज सक्रियण का संकेत देता है जो आमतौर पर स्वस्थ साथियों में नहीं देखा जाता है।

जीवाणु या यूकेरियोट कोशिकाओं में डीएनए को दागने के लिए आमतौर पर 0.1–12 μg/ml की सांद्रता का उपयोग किया जाता है। कोशिकाओं को कमरे के तापमान या 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-30 मिनट के लिए दाग दिया जाता है और फिर अनबाउंड डाई को हटाने के लिए धोया जाता है। अनबाउंड होचस्ट डाई का एक हरा प्रतिदीप्ति उन नमूनों पर देखा जा सकता है जो बहुत अधिक डाई से दागे गए हैं या जो आंशिक रूप से धोए गए हैं।[3]Hoechst रंजक अक्सर DAPI नामक एक अन्य न्यूक्लिक एसिड दाग के विकल्प के रूप में उपयोग किए जाते हैं।

होचस्ट रंजक और डीएपीआई के बीच मुख्य अंतर हैं:

  • होचस्ट डाई डीएपीआई की तुलना में कम विषैले होते हैं, जो दागदार कोशिकाओं की उच्च व्यवहार्यता सुनिश्चित करते हैं।[5]
  • कुछ होचस्ट रंगों (होचस्ट 33342) में अतिरिक्त एथिल समूह उन्हें अधिक सेल-पारगम्य बनाता है।[6]
  • न्यूक्लियर स्टेनिंग डाई हैं जो स्टेनिंग के बाद कोशिकाओं की व्यवहार्यता की अनुमति देते हैं।[citation needed]

Hoechst 33342 और 33258 ब्रोमोडॉक्सीयूरिडीन (BrdU) द्वारा शमन (प्रतिदीप्ति) हैं, जो आमतौर पर विभाजित कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है। Hoechst 33342 H 33258 की तुलना में 10 गुना अधिक सेल-पारगम्यता प्रदर्शित करता है। सेल नए संश्लेषित डीएनए में थाइमिडीन के विकल्प के रूप में BrdU को एकीकृत कर सकते हैं। जब BrdU को डीएनए में एकीकृत किया जाता है, तो यह माना जाता है कि ब्रोमिन मामूली खांचे को विकृत कर देता है ताकि होचस्ट डाई अपने इष्टतम बंधन स्थल तक नहीं पहुंच सके। होचस्ट रंगों की बाइंडिंग BrdU-प्रतिस्थापित डीएनए से भी मजबूत है; हालाँकि, कोई प्रतिदीप्ति नहीं होती है। सेल चक्र की प्रगति की निगरानी के लिए Hoechst रंगों का उपयोग BrdU के साथ किया जा सकता है।[7][8] निम्नलिखित अनुप्रयोगों में जीनोमिक डीएनए को दागने के लिए आमतौर पर होचस्ट रंजक का उपयोग किया जाता है:

Hoechst efflux का उपयोग हेमेटोपोएटिक और भ्रूण स्टेम सेल का अध्ययन करने के लिए भी किया जाता है। चूँकि ये कोशिकाएँ डाई को प्रभावी ढंग से प्रवाहित करने में सक्षम होती हैं, उन्हें फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से पता लगाया जा सकता है जिसे पक्ष की आबादी कहा जाता है। यह लाल और नीले दोनों फिल्टर के माध्यम से उत्तेजित होचस्ट से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति को पारित करके और एक दूसरे के खिलाफ लाल और नीले रंग की साजिश रचने के द्वारा किया जाता है।[citation needed]


विषाक्तता और सुरक्षा

क्योंकि होचस्ट के दाग डीएनए से जुड़ते हैं, वे माइटोसिस के दौरान डीएनए प्रतिकृति में हस्तक्षेप करते हैं। नतीजतन, वे संभावित रूप से उत्परिवर्तनीय और कासीनजनिक हैं, इसलिए उनके प्रबंधन और निपटान में सावधानी बरती जानी चाहिए। होचस्ट दाग का उपयोग पशुधन और मनुष्यों में शुक्राणु छँटाई के लिए किया जाता है। इसकी सुरक्षा पर बहस हुई है।[13][14]


यह भी देखें


संदर्भ

  1. ↑ Latt, SA; Stetten, G; Juergens, LA; Willard, HF; Scher, CD (July 1975). "Recent developments in the detection of deoxyribonucleic acid synthesis by 33258 Hoechst fluorescence". Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 23 (7): 493–505. doi:10.1177/23.7.1095650. PMID 1095650.
  2. ↑ Latt, SA; Stetten, G (January 1976). "Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis". Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 24 (1): 24–33. doi:10.1177/24.1.943439. PMID 943439.
  3. ↑ 3.0 3.1 3.2 "Hoechst Stains" (PDF). Invitrogren (Molecular Probes). Archived from the original (PDF) on 2009-04-19.
  4. ↑ Portugal, J; Waring, MJ (Feb 28, 1988). "Assignment of DNA binding sites for 4′,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 949 (2): 158–68. doi:10.1016/0167-4781(88)90079-6. PMID 2449244.
  5. ↑ BD Bioscience (2009). Techniques for Immune Function Analysis (PDF) (2 ed.). Becton, Dickinson and Company.
  6. ↑ Bucevičius, Jonas; Lukinavičius, Gražvydas; Gerasimaitė, Rūta (2018-04-18). "The Use of Hoechst Dyes for DNA Staining and beyond". Chemosensors (in English). 6 (2): 18. doi:10.3390/chemosensors6020018. ISSN 2227-9040.
  7. ↑ Kubbies, M; Rabinovitch, PS (January 1983). "Flow cytometric analysis of factors which influence the BrdUrd-Hoechst quenching effect in cultivated human fibroblasts and lymphocytes". Cytometry. 3 (4): 276–81. doi:10.1002/cyto.990030408. PMID 6185287.
  8. ↑ Breusegem, SY; Clegg, RM; Loontiens, FG (Feb 1, 2002). "Base-sequence specificity of Hoechst 33258 and DAPI binding to five (A/T)4 DNA sites with kinetic evidence for more than one high-affinity Hoechst 33258-AATT complex". Journal of Molecular Biology. 315 (5): 1049–61. doi:10.1006/jmbi.2001.5301. PMID 11827475.
  9. ↑ Iain Johnson, Michelle T.Z. Spence, ed. (2011). Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies (11 ed.). Invitrogen. ISBN 978-0-9829279-1-5.
  10. ↑ Kubbies, M (1990). "Flow cytometric recognition of clastogen induced chromatin damage in G0/G1 lymphocytes by non-stoichiometric Hoechst fluorochrome binding". Cytometry. 11 (3): 386–94. doi:10.1002/cyto.990110309. PMID 1692786.
  11. ↑ 11.0 11.1 Mocharla, R; Mocharla, H; Hodes, ME (Dec 23, 1987). "A novel, sensitive fluorometric staining technique for the detection of DNA in RNA preparations". Nucleic Acids Research. 15 (24): 10589. doi:10.1093/nar/15.24.10589. PMC 339970. PMID 2447564.
  12. ↑ Sterzel, W; Bedford, P; Eisenbrand, G (June 1985). "Automated determination of DNA using the fluorochrome Hoechst 33258". Analytical Biochemistry. 147 (2): 462–7. doi:10.1016/0003-2697(85)90299-4. PMID 2409841.
  13. ↑ Ashwood-Smith, M.J. (1994). "Safety of human sperm selection by flow cytometry". Human Reproduction. Oxford University Press. 9 (5): 757–759. doi:10.1093/oxfordjournals.humrep.a138589. PMID 7929716.
  14. ↑ Parrilla, I; Vázquez, J M; Cuello, C; Gil, MA; Roca, J; Di Berardino, D; Martínez, EA (2004). "Hoechst 33342 stain and u.v. laser exposure do not induce genotoxic effects in flow-sorted boar spermatozoa". Reproduction. 128 (5): 615–621. doi:10.1530/rep.1.00288. PMID 15509707.


बाहरी संबंध

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