प्रतिदीप्ति-आजीवन इमेजिंग माइक्रोस्कोपी: Difference between revisions
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फ्लोरेसेंस-आजीवन छवि माइक्रोस्कोपी या फ़्लिम एक छवि विधि है जो एक नमूने से [[ फ्लोरोफोरे |फ्लोरोफोरे]] के फोटॉन उत्सर्जन की [[घातीय क्षय]] दर में अंतर पर आधारित है। इसे [[संनाभि माइक्रोस्कोपी]], [[दो फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी]] और मल्टीफोटोन टोमोग्राफी में छवि विधि के रूप में उपयोग किया जा सकता है। | |||
फ़्लोरोफ़ोर की [[रोशनी|प्रकाश]] आजीवन (एफएलटी), इसकी तीव्रता के अतिरिक्त , फ़्लिम में छवि बनाने के लिए उपयोग की जाती है। प्रतिदीप्ति जीवनकाल फ्लोरोफोर के स्थानीय सूक्ष्म पर्यावरण पर निर्भर करता है, इस प्रकार प्रकाश स्रोत, पृष्ठभूमि प्रकाश की तीव्रता या सीमित फोटो-विरंजन की चमक में परिवर्तन के कारण प्रतिदीप्ति तीव्रता में किसी भी गलत माप को रोकता है। इस विधि में नमूने की मोटी परतों में फोटॉन के प्रकीर्णन के प्रभाव को कम करने का भी लाभ है। सूक्ष्म पर्यावरण आजीवन माप पर निर्भर होने के कारण पीएच [[श्यानता]] और रासायनिक प्रजातियों की एकाग्रता के लिए एक संकेतक के रूप में उपयोग किया गया है '''सूक्ष्म-पर्यावरण पर निर्भर होने के कारण, [[पीएच]] के संकेतक के रूप में आजीवन मापन का उपयोग किया गया है''',<ref>{{cite journal |last1=Nakabayashi |first1=Takakazu |last2=Wang |first2=Hui-Ping |last3=Kinjo |first3=Masataka |last4=Ohta |first4=Nobuhiro |title=इंट्रासेल्यूलर पीएच मापन के लिए बढ़ी हुई हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग का अनुप्रयोग|journal=Photochemical & Photobiological Sciences |date=4 June 2008 |volume=7 |issue=6 |pages=668–670 |doi=10.1039/B800391B |pmid=18528549 |url=https://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2008/pp/b800391b |language=en |issn=1474-9092}}</ref> [[श्यानता|'''श्यानता''']]<ref>{{cite journal |last1=Levitt |first1=James A. |last2=Kuimova |first2=Marina K. |last3=Yahioglu |first3=Gokhan |last4=Chung |first4=Pei-Hua |last5=Suhling |first5=Klaus |last6=Phillips |first6=David |title=मेम्ब्रेन-बाउंड मॉलिक्यूलर रोटर्स फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में चिपचिपाहट को मापते हैं|journal=The Journal of Physical Chemistry C |date=9 July 2009 |volume=113 |issue=27 |pages=11634–11642 |doi=10.1021/jp9013493 |url=https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp9013493 |issn=1932-7447|hdl=10044/1/15590 |s2cid=96097931 |hdl-access=free }}</ref> '''और रासायनिक प्रजातियों की [[एकाग्रता]]'''।<ref>{{cite journal |last1=Ruedas-Rama |first1=Maria J. |last2=Orte |first2=Angel |last3=Hall |first3=Elizabeth A. H. |last4=Alvarez-Pez |first4=Jose M. |last5=Talavera |first5=Eva M. |title=टाइम-सॉल्युड फ्लोरीमेट्री और फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग के लिए क्लोराइड आयन नैनोसेंसर|journal=Analyst |date=20 February 2012 |volume=137 |issue=6 |pages=1500–1508 |doi=10.1039/C2AN15851E |pmid=22324050 |bibcode=2012Ana...137.1500R |url=https://pubs.rsc.org/--/content/articlehtml/2012/an/c2an15851e |language=en |issn=1364-5528}}</ref><ref>{{cite journal|last1=Agronskaia|first1=Alexandra V.|last2=Tertoolen|first2=L.|last3=Gerritsen|first3=Hans C.|date=November 2004|title=जीवित कोशिकाओं में कैल्शियम की फास्ट फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग|url=https://www.spiedigitallibrary.org/journals/Journal-of-Biomedical-Optics/volume-9/issue-6/0000/Fast-fluorescence-lifetime-imaging-of-calcium-in-living-cells/10.1117/1.1806472.full?SSO=1|journal=Journal of Biomedical Optics|volume=9|issue=6|pages=1230–1237|doi=10.1117/1.1806472|pmid=15568944|bibcode=2004JBO.....9.1230A|issn=1083-3668}}</ref> | |||
== प्रतिदीप्ति जीवनकाल == | == प्रतिदीप्ति जीवनकाल == | ||
एक फ्लोरोफोर जो एक फोटॉन द्वारा उत्साहित अवस्था है, कई अलग-अलग (विकिरण और/या गैर-विकिरण) क्षय मार्गों के माध्यम से क्षय दर के आधार पर एक निश्चित संभावना के साथ | एक फ्लोरोफोर जो एक फोटॉन द्वारा उत्साहित अवस्था है, कई अलग-अलग (विकिरण और/या गैर-विकिरण) क्षय मार्गों के माध्यम से क्षय दर के आधार पर एक निश्चित संभावना के साथ समतल अवस्था में गिर जाएगा। प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करने के लिए, इनमें से एक मार्ग एक फोटॉन के स्वतःस्फूर्त उत्सर्जन द्वारा होना चाहिए। [[सांख्यिकीय पहनावा]] विवरण में, उत्सर्जित प्रतिदीप्ति समय के अनुसार क्षय हो जाएगी | ||
:<math>I(t) = I_0 e^{-t/\tau}</math> | :<math>I(t) = I_0 e^{-t/\tau}</math> | ||
जहाँ | |||
:<math>\frac{1}{\tau} = \sum k_i</math>. | :<math>\frac{1}{\tau} = \sum k_i</math>. | ||
ऊपरोक्त में, <math>t</math> यह समय है, <math>\tau</math> प्रतिदीप्ति जीवनकाल है, <math>I_0</math> | ऊपरोक्त में, <math>t</math> यह समय है, <math>\tau</math> प्रतिदीप्ति जीवनकाल है, <math>I_0</math> <math>t=0</math> पर प्रारंभिक प्रतिदीप्ति है, और <math>k_i</math> प्रत्येक क्षय पथ के लिए दरें हैं, जिनमें से कम से कम एक प्रतिदीप्ति क्षय दर होनी चाहिए <math>k_f</math>. इससे भी महत्वपूर्ण बात, जीवन भर, <math>\tau</math> प्रारंभिक तीव्रता और उत्सर्जित प्रकाश से स्वतंत्र है। इसका उपयोग रासायनिक संवेदन में गैर-तीव्रता आधारित माप बनाने के लिए किया जा सकता है।<ref>Joseph R. Lakowicz. [https://books.google.com/books?id=-PSybuLNxcAC Principles of Fluorescence Spectroscopy] 3rd edition. [[Springer Science+Business Media|Springer]] (2006). {{ISBN|978-0387-31278-1}}.{{page needed|date=September 2013}}</ref> | ||
== नाप == | |||
प्रतिदीप्ति-आजीवन छवि <math>\tau</math> द्वारा निर्धारित प्रत्येक पिक्सेल की तीव्रता के साथ छवियां प्राप्त होती हैं, जो अलग-अलग प्रतिदीप्ति क्षय दर वाली पदार्थो के बीच अंतर देखने की अनुमति देता है (तथापि वे पदार्थ बिल्कुल समान तरंग दैर्ध्य पर प्रतिदीप्त हों), और ऐसी छवियां भी उत्पन्न करती हैं जो अन्य क्षय मार्गों में परिवर्तन दिखाती हैं, जैसे कि [[प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण]] में है। | |||
== | === स्पंदित प्रकाश === | ||
प्रतिदीप्ति | स्पंदित स्रोत का उपयोग करते समय डोमेन में प्रतिदीप्ति जीवन काल निर्धारित किया जा सकता है। | ||
जब फ्लोरोफोरस की आबादी प्रकाश की एक अल्ट्राशॉर्ट या [[डिराक डेल्टा समारोह|डिराक डेल्टा कार्य]] पल्स द्वारा उत्साहित होती है, तो समय-समाधान प्रतिदीप्ति ऊपर वर्णित अनुसार तेजी से क्षय हो जाएगा। चूँकि, अगर उत्तेजना नाड़ी या पता लगाने की प्रतिक्रिया व्यापक है, मापा फ्लोरेसेंस, डी (टी), पूरी तरह से घातीय नहीं होगा। वाद्य प्रतिक्रिया कल्पना, आईआरएफ(t) [[कनवल्शन|दृढ़ संकल्प]] होगा या क्षय कार्य , F(t) के साथ मिश्रित किया जाएगा। | |||
जब फ्लोरोफोरस की आबादी प्रकाश की एक अल्ट्राशॉर्ट या [[डिराक डेल्टा समारोह]] पल्स द्वारा उत्साहित होती है, तो समय-समाधान प्रतिदीप्ति ऊपर वर्णित अनुसार तेजी से क्षय हो जाएगा। | |||
<math>{d}(t) = {IRF}(t) \otimes {F}(t)</math> | <math>{d}(t) = {IRF}(t) \otimes {F}(t)</math> | ||
स्रोत, | |||
स्रोत, संसूचक और इलेक्ट्रॉनिक्स की वाद्य प्रतिक्रिया को सामान्यतः बिखरे हुए उत्तेजना प्रकाश से मापा जा सकता है। क्षय फलन (और संबंधित जीवनकाल) को पुनर्प्राप्त करना अतिरिक्त चुनौतियों का सामना करता है क्योंकि आवृत्ति डोमेन में विभाजन उच्च ध्वनि उत्पन्न करता है जब भाजक शून्य के समीप होता है। | |||
==== [[टीसीएसपीसी]] ==== | ==== [[टीसीएसपीसी]] ==== | ||
समय-सहसंबंधित एकल-फोटॉन गणना ( | समय-सहसंबंधित एकल-फोटॉन गणना (टीसीएसपीसी) सामान्यतः नियोजित होती है क्योंकि यह स्रोत तीव्रता और एकल फोटॉन पल्स आयाम में भिन्नता के लिए क्षतिपूर्ति करती है। | ||
व्यावसायिक | |||
दर्ज प्रतिदीप्ति क्षय हिस्टोग्राम पोइसन वितरण का पालन करता है जिसे फिटिंग के | व्यावसायिक टीसीएसपीसी उपकरण का उपयोग करके एक प्रतिदीप्ति क्षय वक्र को 405 fs तक के समय प्रस्ताव के साथ सूची किया जा सकता है। {{Citation needed|date=August 2021}} <ref>{{cite web |url=http://becker-hickl.com/spc150nx.htm |title=SPC-150NX, Product description |publisher=Becker & Hickl GmbH |date=April 26, 2017 |website=Becker & Hickl|access-date=April 26, 2017}}</ref> | ||
अधिक विशेष रूप से, | |||
रिकॉर्डिंग कई लेजर | दर्ज प्रतिदीप्ति क्षय हिस्टोग्राम पोइसन वितरण का पालन करता है जिसे फिटिंग के समय फिट की अच्छाई का निर्धारण करने में माना जाता है। | ||
अधिक विशेष रूप से, टीसीएसपीसी उत्तेजना लेजर पल्स के संबंध में एक तेज एकल-फोटॉन संसूचक (सामान्यतः एक फोटो-मल्टीप्लायर ट्यूब ([[फोटोमल्टीप्लायर]]) या एक फोटॉन हिमस्खलन फोटो डायोड (एसपीएडी)) द्वारा अलग-अलग फोटोन का पता लगाने के समय को सूची करता है। | |||
रिकॉर्डिंग कई लेजर स्पंद के लिए दोहराई जाती है और पर्याप्त सूची की गई घटनाओं के बाद, इन सभी सूची किए गए समय बिंदुओं में घटनाओं की संख्या का हिस्टोग्राम बनाने में सक्षम होता है। | |||
यह हिस्टोग्राम तब एक घातांकीय कार्यन के लिए फिट हो सकता है जिसमें ब्याज का घातांकीय आजीवन क्षय कार्य होता है, और आजीवन पैरामीटर तदनुसार निकाला जा सकता है। | |||
16 से 64 तत्वों वाले मल्टी-चैनल पीएमटी प्रणाली व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं,<ref>{{cite web |url=http://becker-hickl.com/PML-16_.htm |title=PML-16, Product description |publisher=Becker & Hickl GmbH |date=April 26, 2017 |website=Becker & Hickl|access-date=April 26, 2017}}</ref> जबकि वर्तमान में प्रदर्शित सीएमओएस एकल-फोटॉन हिमस्खलन डायोड (एसपीएडी)-टीसीएसपीसी फ़्लिम प्रणाली अधिक संख्या में डिटेक्शन चैनल और अतिरिक्त कम लागत वाले विकल्प प्रदान कर सकते हैं।<ref>{{cite journal |doi=10.1364/OE.18.010257 |title=Real-time fluorescence lifetime imaging system with a 32 × 32 0.13μm CMOS low dark-count single-photon avalanche diode array |year=2010 |last1=Li |first1=Day-Uei |last2=Arlt |first2=Jochen |last3=Richardson |first3=Justin |last4=Walker |first4=Richard |last5=Buts |first5=Alex |last6=Stoppa |first6=David |last7=Charbon |first7=Edoardo |last8=Henderson |first8=Robert |journal=Optics Express |volume=18 |issue=10 |pages=10257–69 |pmid=20588879|bibcode = 2010OExpr..1810257L |url=http://resolver.tudelft.nl/uuid:b4433957-0951-4eb6-9181-e0992505f366 |doi-access=free }}</ref> | |||
==== गेटिंग विधि ==== | ==== गेटिंग विधि ==== | ||
पल्स उत्तेजना अभी भी इस विधि में प्रयोग किया जाता है। स्पंद के नमूने तक पहुंचने से पहले, कुछ प्रकाश एक डाइक्रोइक दर्पण द्वारा परावर्तित होता है और | पल्स उत्तेजना अभी भी इस विधि में प्रयोग किया जाता है। स्पंद के नमूने तक पहुंचने से पहले, कुछ प्रकाश एक डाइक्रोइक दर्पण द्वारा परावर्तित होता है और फोटोडायोड द्वारा पता लगाया जाता है जो सीसीडी संसूचक के सामने स्थित एक गेटेड प्रकाशीय तीव्रता (जीओआई) को नियंत्रित करने वाले विलंब जनरेटर को सक्रिय करता है। भारत सरकार केवल उस समय के अंश का पता लगाने की अनुमति देती है जब यह देरी के बाद खुला होता है। इस प्रकार, एक समायोज्य देरी जनरेटर के साथ, एक नमूना के प्रतिदीप्ति क्षय की समय सीमा को सम्मिलित करते हुए कई विलंब समय के बाद प्रतिदीप्ति उत्सर्जन एकत्र करने में सक्षम है।<ref>{{cite book |pmid=17519182 |year=2007 |last1=Chang |first1=CW |last2=Sud |first2=D |last3=Mycek |first3=MA |title=प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग माइक्रोस्कोपी|volume=81 |pages=[https://archive.org/details/digitalmicroscop00gree/page/495 495–524] |doi=10.1016/S0091-679X(06)81024-1 |series=Methods in Cell Biology |isbn=9780123740250 |url-access=registration |url=https://archive.org/details/digitalmicroscop00gree/page/495 }}</ref><ref>{{cite journal |bibcode=2004NJPh....6..180E |title=सेगमेंटेड ऑप्टिकल इमेज इंटेंसिफायर के साथ सिंगल-शॉट अधिग्रहण सहित रीयल-टाइम टाइम-डोमेन फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग|last1=Elson |first1=D. S. |last13=French |volume=6 |issue=1 |year=2004 |pages=180 |journal=New Journal of Physics |doi=10.1088/1367-2630/6/1/180 |first2=I |first3=J |first4=J |first5=C |first6=N |first7=G W |first8=M A A |first9=M J |first10=P A |first12=J |first13=P M W |last2=Munro |last3=Requejo-Isidro |last4=McGinty |last5=Dunsby |last6=Galletly |last7=Stamp |last8=Neil |last9=Lever |last10=Kellett |last11=Dymoke-Bradshaw |first11=A |last12=Hares|doi-access=free }}</ref> वर्तमान के वर्षों में एकीकृत सघन सीसीडी कैमरों ने बाजार में प्रवेश किया है। इन कैमरों में एक छवि गहनता, सीसीडी सेंसर और एक एकीकृत विलंब जनरेटर सम्मिलित है। कम से कम 200ps के गेटिंग समय वाले सीसीडी कैमरे और 10ps के विलंब चरण उप-नैनोसेकंड प्रस्ताव फ़्लिम की अनुमति देते हैं। एंडोस्कोप के संयोजन में इस विधि का उपयोग ब्रेन ट्यूमर के अंतर शल्य चिकित्सा निदान के लिए किया जाता है।<ref>{{cite journal |year=2010 |last1=Sun |first1=Yinghua |last2=Hatami |first2=Nisa |last3=Yee |first3=Matthew |last4=Marcu |first4=Jennifer |last5=Elson |first5=Daniel S. |last6=Gorin |first6=Fredric |last7=Schrot |first7=Rudolph J. |last8=Phipps |first8=Laura |title=ब्रेन ट्यूमर इमेज-गाइडेड सर्जरी के लिए फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी|volume=15 |issue=5 |pages=056022–056022–5 |doi=10.1117/1.3486612 |pmid=21054116 |pmc=2966493 |journal=Journal of Biomedical Optics|bibcode = 2010JBO....15e6022S |url=http://spiral.imperial.ac.uk/bitstream/10044/1/9885/2/Sun_2010_Fluorescence%20lifetime%20imaging%20microscopy%20for%20brain%20tumou%20image-guided%20surgery_JBO.pdf }}</ref> | ||
=== चरण मॉडुलन === | === चरण मॉडुलन === | ||
चरण-मॉड्यूलेशन विधि द्वारा आवृत्ति डोमेन में प्रतिदीप्ति जीवन काल निर्धारित किया जा सकता है। विधि एक ऐसे प्रकाश स्रोत का उपयोग करती है जो उच्च आवृत्ति (500 मेगाहर्ट्ज तक) पर स्पंदित या संशोधित होता है, जैसे कि एक एलईडी, डायोड लेजर या एक [[ध्वनिक-ऑप्टिक न्यूनाधिक]] या एक ध्वनि- | चरण-मॉड्यूलेशन विधि द्वारा आवृत्ति डोमेन में प्रतिदीप्ति जीवन काल निर्धारित किया जा सकता है। विधि एक ऐसे प्रकाश स्रोत का उपयोग करती है जो उच्च आवृत्ति (500 मेगाहर्ट्ज तक) पर स्पंदित या संशोधित होता है, जैसे कि एक एलईडी, डायोड लेजर या एक [[ध्वनिक-ऑप्टिक न्यूनाधिक|ध्वनिक-प्रकाशिकी न्यूनाधिक]] या एक ध्वनि-प्रकाशिकी मॉड्यूलेटर के साथ संयुक्त एक सतत तरंग स्रोत। प्रतिदीप्ति है (ए।) विमॉडुलित और (बी।) चरण स्थानांतरित; दोनों मात्राएँ फ्लोरोफोर के विशिष्ट क्षय समय से संबंधित हैं। इसके अलावा, उत्तेजना और प्रतिदीप्ति साइन तरंगों के y-घटकों को संशोधित किया जाएगा, और इन y-घटकों के मॉडुलन अनुपात से जीवनकाल निर्धारित किया जा सकता है। इसलिए, जीवन भर के लिए 2 मान चरण-मॉड्यूलेशन विधि से निर्धारित किए जा सकते हैं। जीवनकाल इन प्रायोगिक मापदंडों की उपयुक्त प्रक्रियाओं के माध्यम से निर्धारित किया जाता है। पीएमटी-आधारित या कैमरा-आधारित आवृत्ति डोमेन फ़्लिम का लाभ इसकी तेज़ आजीवन छवि अधिग्रहण है, जो इसे लाइव सेल अनुसंधान जैसे अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त बनाता है।<ref>Gadella, T.W.J., editor, FRET and FLIM techniques. Elsevier, 2009 https://books.google.com/books/about/FRET_and_FLIM_Techniques.html?id=uHvqu4hLhH8C&redir_esc=y{{page needed|date=September 2013}}</ref> | ||
== विश्लेषण == | == विश्लेषण == | ||
विश्लेषण एल्गोरिथम का लक्ष्य मापा क्षय से शुद्ध क्षय वक्र को निकालना और जीवनकाल (ओं) का अनुमान लगाना है। उत्तरार्द्ध | विश्लेषण एल्गोरिथम का लक्ष्य मापा क्षय से शुद्ध क्षय वक्र को निकालना और जीवनकाल (ओं) का अनुमान लगाना है। उत्तरार्द्ध सामान्यतः एकल या बहु घातीय कार्यों को फिट करके पूरा किया जाता है। इस समस्या को हल करने के लिए कई तरह के तरीके विकसित किए गए हैं। सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि कम से कम वर्ग पुनरावृत्ति पुन: कनवल्शन है जो अवशिष्टों के भारित योग को कम करने पर आधारित है। इस विधि में सैद्धांतिक घातीय क्षय वक्रों को उपकरण प्रतिक्रिया कार्य के साथ जटिल किया जाता है, जिसे अलग से मापा जाता है, और सबसे अच्छा फिट अलग-अलग इनपुट के लिए अवशिष्टों की पुनरावृत्त गणना द्वारा पाया जाता है जब तक कि न्यूनतम नहीं मिल जाता। टिप्पणियों के एक सेट के लिए <math>d({{t}_{i}})</math> समय बिन i में प्रतिदीप्ति संकेत का, आजीवन अनुमान निम्न के न्यूनतमकरण द्वारा किया जाता है: | ||
<math>{{\chi }^{2}}=\sum\limits_{i}{{{\left[ {{d}_{i}}({{t}_{i}})-{{d}_{0i}}({{t}_{i}},a,\tau ) \right]}^{2}}}</math> | <math>{{\chi }^{2}}=\sum\limits_{i}{{{\left[ {{d}_{i}}({{t}_{i}})-{{d}_{0i}}({{t}_{i}},a,\tau ) \right]}^{2}}}</math> | ||
प्रयोगात्मक कठिनाइयों के अलावा, तरंग दैर्ध्य पर निर्भर साधन प्रतिक्रिया समारोह सहित, पुनरावृत्त डी-कनवॉल्यूशन समस्या का गणितीय उपचार सीधे आगे नहीं है और यह एक धीमी प्रक्रिया है जो | प्रयोगात्मक कठिनाइयों के अलावा, तरंग दैर्ध्य पर निर्भर साधन प्रतिक्रिया समारोह सहित, पुनरावृत्त डी-कनवॉल्यूशन समस्या का गणितीय उपचार सीधे आगे नहीं है और यह एक धीमी प्रक्रिया है जो फ़्लिम के शुरुआती दिनों में पिक्सेल-दर-पिक्सेल विश्लेषण के लिए अव्यावहारिक बना दिया। | ||
गैर-फिटिंग तरीके आकर्षक हैं क्योंकि वे जीवन भर के आकलन के लिए बहुत तेज़ समाधान प्रदान करते हैं। इस श्रेणी की प्रमुख और सीधी तकनीकों में से एक रैपिड | गैर-फिटिंग तरीके आकर्षक हैं क्योंकि वे जीवन भर के आकलन के लिए बहुत तेज़ समाधान प्रदान करते हैं। इस श्रेणी की प्रमुख और सीधी तकनीकों में से एक रैपिड आजीवन निर्धारण (आरएलडी) विधि है। RLD क्षय वक्र को समान चौड़ाई के दो भागों में विभाजित करके जीवन काल और उनके आयामों की सीधे गणना करता है <math>\delta</math>टी। समान समय अंतराल में क्षय वक्र को एकीकृत करके विश्लेषण किया जाता है <math>\delta</math>टी: | ||
<math>\begin{matrix} | <math>\begin{matrix} | ||
{{D}_{0}}=\sum\limits_{i=1}^{K/2}{{{I}_{i}}\delta t} & {{D}_{1}}=\sum\limits_{i=K/2}^{K}{{{I}_{i}}\delta t} \\ | {{D}_{0}}=\sum\limits_{i=1}^{K/2}{{{I}_{i}}\delta t} & {{D}_{1}}=\sum\limits_{i=K/2}^{K}{{{I}_{i}}\delta t} \\ | ||
\end{matrix}</math> | \end{matrix}</math> | ||
Ii, i-वें चैनल में | Ii, i-वें चैनल में सूची किया गया संकेत है और K चैनलों की संख्या है। जीवनकाल का अनुमान लगाया जा सकता है: | ||
<math>\tau =\delta t/\ln ({{D}_{0}}/{{D}_{1}})</math> | <math>\tau =\delta t/\ln ({{D}_{0}}/{{D}_{1}})</math> | ||
Line 65: | Line 69: | ||
<math>\tau =\frac{1}{n\omega }\frac{{{A}_{n}}}{{{B}_{n}}}</math> | <math>\tau =\frac{1}{n\omega }\frac{{{A}_{n}}}{{{B}_{n}}}</math> | ||
जहाँ : | |||
<math>\begin{matrix} | <math>\begin{matrix} | ||
Line 73: | Line 77: | ||
== अनुप्रयोग == | == अनुप्रयोग == | ||
फ़्लिम मुख्य रूप से जीव विज्ञान में कोशिकाओं और ट्यूमर में फोटोसेंसिटाइज़र का पता लगाने के साथ-साथ उन मामलों में FRET के रूप में उपयोग किया जाता है जहां [[रतिमितीय इमेजिंग|रतिमितीय]] छवि मुश्किल है। | |||
इस | इस विधि को 1980 के दशक के अंत और 1990 के दशक की शुरुआत में विकसित किया गया था (गेटिंग विधि: बुगेल एट अल। 1989। कोनिग 1989,<ref>{{cite journal |bibcode=1993BpJ....64..676O |title=प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (फ्लिमस्कोपी)। एकल कोशिकाओं में एंडोसोम फ्यूजन के अध्ययन के लिए कार्यप्रणाली विकास और अनुप्रयोग|last1=Oida |first1=T. |volume=64 |year=1993 |pages=676–85 |journal=Biophysical Journal |doi=10.1016/S0006-3495(93)81427-9 |pmid=8471720 |last2=Sako |first2=Y |last3=Kusumi |first3=A |issue=3 |pmc=1262380}}</ref> चरण मॉडुलन: Lakowicz एट अल। 1992,<ref>{{cite journal |doi=10.1016/0003-2697(92)90112-K |title=प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग|year=1992 |last1=Lakowicz |first1=Joseph R. |last2=Szmacinski |first2=Henryk |last3=Nowaczyk |first3=Kazimierz |last4=Berndt |first4=Klaus W. |last5=Johnson |first5=Michael |journal=Analytical Biochemistry |volume=202 |issue=2 |pages=316–30 |pmid=1519759|pmc=6986422 }}</ref><ref>{{cite journal |bibcode=1992PNAS...89.1271L |title=फ्री और प्रोटीन-बाउंड एनएडीएच की फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग|last1=Lakowicz |first1=Joseph R. |last4=Johnson |volume=89 |year=1992 |pages=1271–5 |journal=Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America |doi=10.1073/pnas.89.4.1271 |pmid=1741380 |first2=H |first3=K |first4=ML |issue=4 |pmc=48431 |last2=Szmacinski |last3=Nowaczyk|doi-access=free }}</ref>) 1990 के दशक के अंत में अधिक व्यापक रूप से लागू होने से पहले। सेल कल्चर में, इसका उपयोग [[ईजीएफ रिसेप्टर]] सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए किया गया है<ref>{{cite journal |doi=10.1016/S0960-9822(99)80484-9 |title=कोशिकाओं में रिसेप्टर टाइरोसिन किनसे गतिविधि की प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग|year=1999 |last1=Wouters |first1=Fred S. |last2=Bastiaens |first2=Philippe I.H. |journal=Current Biology |volume=9 |issue=19 |pages=1127–30 |pmid=10531012|s2cid=7640970 |doi-access=free }}</ref> और तस्करी।<ref>{{cite journal |bibcode=2000Sci...290.1567V |title=प्लाज्मा झिल्ली में पार्श्व ErbB1 रिसेप्टर सिग्नल प्रसार की मात्रात्मक इमेजिंग|last1=Verveer |first1=Peter J. |last4=Bastiaens |volume=290 |year=2000 |pages=1567–70 |journal=Science |doi=10.1126/science.290.5496.1567 |pmid=11090353 |first2=FS |first3=AR |first4=PI |issue=5496 |last2=Wouters |last3=Reynolds}}</ref> टाइम डोमेन फ़्लिम (tdFLIM) का उपयोग परमाणु लिफाफे में अलग-अलग होमोपोलिमर्स में दोनों प्रकार के परमाणु मध्यवर्ती फिलामेंट प्रोटीन विटामिन ए और बी 1 की बातचीत को दिखाने के लिए किया गया है, जो उच्च क्रम संरचनाओं में एक दूसरे के साथ बातचीत करते हैं।<ref>{{cite journal|last1=Delbarre|first1=Erwan|last2=Tramier|first2=Marc|last3=Coppey-Moisan|first3=Maïté|last4=Gaillard|first4=Claire|last5=Courvalin|first5=Jean-Claude|last6=Buendia|first6=Brigitte|title=The truncated prelamin A in Hutchinson–Gilford progeria syndrome alters segregation of A-type and B-type lamin homopolymers|journal=Human Molecular Genetics|volume=15|issue=7|pages=1113–1122|doi=10.1093/hmg/ddl026|pmid=16481358|year=2006|url=https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00019639/file/Delbarre_HumMolGenet_2006.pdf|doi-access=free}}</ref> फ़्लिम छवि विशेष रूप से न्यूरॉन्स में उपयोगी है, जहां मस्तिष्क के ऊतकों द्वारा प्रकाश का बिखरना रतिमितीय छवि के लिए समस्याग्रस्त है।<ref>{{cite journal |doi=10.1016/j.conb.2006.08.012 |title=प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण और प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके न्यूरोनल सिग्नलिंग के स्पोटियोटेम्पोरल गतिकी का इमेजिंग|year=2006 |last1=Yasuda |first1=Ryohei |journal=Current Opinion in Neurobiology |volume=16 |issue=5 |pages=551–61 |pmid=16971112|s2cid=54398436 }}</ref> न्यूरॉन्स में, स्पंदित प्रकाश का उपयोग करते हुए फ़्लिम छवि का उपयोग [[रास (प्रोटीन)]] का अध्ययन करने के लिए किया गया है,<ref>{{cite journal |bibcode=2008Sci...321..136H |title=एकल वृक्ष के समान रीढ़ की सक्रियता से शुरू हुई रास गतिविधि का प्रसार|last1=Harvey |first1 = Christopher D.|author4-link=Karel Svoboda (scientist) |last4=Svoboda |volume=321 |year=2008 |pages=136–40 |journal=Science |doi=10.1126/science.1159675 |pmid=18556515 |first2=R |first3=H |first4=K |issue=5885 |pmc=2745709 |last2=Yasuda |last3=Zhong}}</ref> [[CaMKII]], [[Rac (GTPase)]], और रैन<ref>{{cite journal |doi=10.1016/j.ymeth.2010.01.022 |title=The design of Förster (fluorescence) resonance energy transfer (FRET)-based molecular sensors for Ran GTPase |year=2010 |last1=Kaláb |first1=Petr |last2=Soderholm |first2=Jon |journal=Methods |volume=51 |issue=2 |pages=220–32 |pmid=20096786 |pmc=2884063}}</ref> पारिवारिक प्रोटीन। फ़्लिम का उपयोग इंट्राडर्मल कैंसर कोशिकाओं के साथ-साथ फार्मास्युटिकल और कॉस्मेटिक यौगिकों का पता लगाने के लिए क्लिनिकल मल्टीफ़ोटो टोमोग्राफी में किया गया है। | ||
वर्तमान में फ़्लिम का उपयोग पादप कोशिकाओं में [[फ्लेवनॉल्स]] का पता लगाने के लिए भी किया गया है।<ref>{{cite journal |doi=10.1016/j.aca.2011.12.068 |url=https://zenodo.org/record/1038611|title=फ्लेवनॉल्स के परमाणु संघ का पता लगाने के लिए पिको-सेकंड प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग के साथ दो-फोटॉन उत्तेजना|year=2012 |last1=Mueller-Harvey |first1=Irene |last2=Feucht |first2=Walter |last3=Polster |first3=Juergen |last4=Trnková |first4=Lucie |last5=Burgos |first5=Pierre |last6=Parker |first6=Anthony W. |last7=Botchway |first7=Stanley W. |journal=Analytica Chimica Acta |volume=719 |pages=68–75 |pmid=22340533|s2cid=24094780 }}</ref> | |||
=== ऑटोफ्लोरोसेंट कोएंजाइम [[ निकोटिनामाइड एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड |निकोटिनामाइड एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड]] |एनएडी(पी)एच और [[फ्लेविन एडेनिन डायन्यूक्लियोटाइड]]<ref>{{Cite journal|last1=Cao|first1=Ruofan|last2=Wallrabe|first2=Horst|last3=Siller|first3=Karsten|last4=Periasamy|first4=Ammasi|date=2020-02-05|title=कोशिकाओं और ऊतकों में ऑटो-फ्लोरोसेंट एनएडी (पी) एच और एफएडी के लिए एफएलआईएम इमेजिंग, फिटिंग और विश्लेषण का अनुकूलन|url=https://doi.org/10.1088/2050-6120/ab6f25|journal=Methods and Applications in Fluorescence|volume=8|issue=2|pages=024001|doi=10.1088/2050-6120/ab6f25|pmid=31972557|bibcode=2020MApFl...8b4001C|s2cid=210883495|issn=2050-6120}}</ref> === | === ऑटोफ्लोरोसेंट कोएंजाइम [[ निकोटिनामाइड एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड |निकोटिनामाइड एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड]] |एनएडी(पी)एच और [[फ्लेविन एडेनिन डायन्यूक्लियोटाइड]]<ref>{{Cite journal|last1=Cao|first1=Ruofan|last2=Wallrabe|first2=Horst|last3=Siller|first3=Karsten|last4=Periasamy|first4=Ammasi|date=2020-02-05|title=कोशिकाओं और ऊतकों में ऑटो-फ्लोरोसेंट एनएडी (पी) एच और एफएडी के लिए एफएलआईएम इमेजिंग, फिटिंग और विश्लेषण का अनुकूलन|url=https://doi.org/10.1088/2050-6120/ab6f25|journal=Methods and Applications in Fluorescence|volume=8|issue=2|pages=024001|doi=10.1088/2050-6120/ab6f25|pmid=31972557|bibcode=2020MApFl...8b4001C|s2cid=210883495|issn=2050-6120}}</ref> === | ||
स्तनधारी चयापचय में परिवर्तन के लिए मार्कर के रूप में कोफ़ेक्टर (जैव रसायन) से ऑटो-प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए मल्टी-फोटॉन | स्तनधारी चयापचय में परिवर्तन के लिए मार्कर के रूप में कोफ़ेक्टर (जैव रसायन) से ऑटो-प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए मल्टी-फोटॉन फ़्लिम का तेजी से उपयोग किया जाता है।<ref>{{Cite journal|last1=Datta|first1=Rupsa|last2=Alfonso-García|first2=Alba|last3=Cinco|first3=Rachel|last4=Gratton|first4=Enrico|date=2015-05-20|title=ऑक्सीडेटिव तनाव के अंतर्जात बायोमार्कर की प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग|journal=Scientific Reports|language=en|volume=5|issue=1|pages=9848|doi=10.1038/srep09848|pmid=25993434|issn=2045-2322|pmc=4438616}}</ref> | ||
=== झल्लाहट इमेजिंग === | === झल्लाहट इमेजिंग === | ||
चूंकि एक फ्लोरोफोर का प्रतिदीप्ति जीवनकाल विकिरण (यानी प्रतिदीप्ति) और गैर-विकिरण (यानी शमन, FRET) दोनों प्रक्रियाओं पर निर्भर करता है, दाता अणु से स्वीकर्ता अणु में ऊर्जा हस्तांतरण दाता के जीवनकाल को कम कर देगा। | चूंकि एक फ्लोरोफोर का प्रतिदीप्ति जीवनकाल विकिरण (यानी प्रतिदीप्ति) और गैर-विकिरण (यानी शमन, FRET) दोनों प्रक्रियाओं पर निर्भर करता है, दाता अणु से स्वीकर्ता अणु में ऊर्जा हस्तांतरण दाता के जीवनकाल को कम कर देगा। | ||
इस प्रकार, | इस प्रकार, फ़्लिम का उपयोग कर झल्लाहट माप फ्लोरोफोर के राज्यों/वातावरणों के बीच भेदभाव करने के लिए एक विधि प्रदान कर सकता है।<ref>{{cite web |first1=Wolfgang |last1=Becker |first2=Axel |last2=Bergmann |title=ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के लिए लाइफटाइम इमेजिंग तकनीक|url=http://www.becker-hickl.de/pdf/tcvgbh1.pdf |year=2003 |pages=4}}</ref> तीव्रता-आधारित FRET मापों के विपरीत, FLIM-आधारित FRET माप भी फ्लोरोफोरस की सांद्रता के प्रति असंवेदनशील होते हैं और इस प्रकार नमूना भर में एकाग्रता और उत्सर्जन तीव्रता में भिन्नता द्वारा पेश की गई कलाकृतियों को फ़िल्टर कर सकते हैं। | ||
== यह भी देखें == | == यह भी देखें == | ||
* प्रतिदीप्ति जीवनकाल और वर्णक्रमीय | * प्रतिदीप्ति जीवनकाल और वर्णक्रमीय छवि के लिए फेजर दृष्टिकोण | ||
==संदर्भ== | ==संदर्भ== | ||
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* Lifetime and spectral analysis tools in ImageJ: http://spechron.com {{Webarchive|url=https://web.archive.org/web/20130311144237/http://spechron.com/ |date=2013-03-11 }} | * Lifetime and spectral analysis tools in ImageJ: http://spechron.com {{Webarchive|url=https://web.archive.org/web/20130311144237/http://spechron.com/ |date=2013-03-11 }} | ||
*[http://users.ox.ac.uk/~atdgroup/optical_flim.shtml Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy] | *[http://users.ox.ac.uk/~atdgroup/optical_flim.shtml Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy] | ||
*[https://www.becker-hickl.com/applications/tcspc-flim/ Principle of | *[https://www.becker-hickl.com/applications/tcspc-flim/ Principle of टीसीएसपीसी] फ़्लिम (Becker&Hickl GmbH) | ||
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Revision as of 14:40, 19 April 2023
फ्लोरेसेंस-आजीवन छवि माइक्रोस्कोपी या फ़्लिम एक छवि विधि है जो एक नमूने से फ्लोरोफोरे के फोटॉन उत्सर्जन की घातीय क्षय दर में अंतर पर आधारित है। इसे संनाभि माइक्रोस्कोपी, दो फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी और मल्टीफोटोन टोमोग्राफी में छवि विधि के रूप में उपयोग किया जा सकता है।
फ़्लोरोफ़ोर की प्रकाश आजीवन (एफएलटी), इसकी तीव्रता के अतिरिक्त , फ़्लिम में छवि बनाने के लिए उपयोग की जाती है। प्रतिदीप्ति जीवनकाल फ्लोरोफोर के स्थानीय सूक्ष्म पर्यावरण पर निर्भर करता है, इस प्रकार प्रकाश स्रोत, पृष्ठभूमि प्रकाश की तीव्रता या सीमित फोटो-विरंजन की चमक में परिवर्तन के कारण प्रतिदीप्ति तीव्रता में किसी भी गलत माप को रोकता है। इस विधि में नमूने की मोटी परतों में फोटॉन के प्रकीर्णन के प्रभाव को कम करने का भी लाभ है। सूक्ष्म पर्यावरण आजीवन माप पर निर्भर होने के कारण पीएच श्यानता और रासायनिक प्रजातियों की एकाग्रता के लिए एक संकेतक के रूप में उपयोग किया गया है सूक्ष्म-पर्यावरण पर निर्भर होने के कारण, पीएच के संकेतक के रूप में आजीवन मापन का उपयोग किया गया है,[1] श्यानता[2] और रासायनिक प्रजातियों की एकाग्रता।[3][4]
प्रतिदीप्ति जीवनकाल
एक फ्लोरोफोर जो एक फोटॉन द्वारा उत्साहित अवस्था है, कई अलग-अलग (विकिरण और/या गैर-विकिरण) क्षय मार्गों के माध्यम से क्षय दर के आधार पर एक निश्चित संभावना के साथ समतल अवस्था में गिर जाएगा। प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करने के लिए, इनमें से एक मार्ग एक फोटॉन के स्वतःस्फूर्त उत्सर्जन द्वारा होना चाहिए। सांख्यिकीय पहनावा विवरण में, उत्सर्जित प्रतिदीप्ति समय के अनुसार क्षय हो जाएगी
जहाँ
- .
ऊपरोक्त में, यह समय है, प्रतिदीप्ति जीवनकाल है, पर प्रारंभिक प्रतिदीप्ति है, और प्रत्येक क्षय पथ के लिए दरें हैं, जिनमें से कम से कम एक प्रतिदीप्ति क्षय दर होनी चाहिए . इससे भी महत्वपूर्ण बात, जीवन भर, प्रारंभिक तीव्रता और उत्सर्जित प्रकाश से स्वतंत्र है। इसका उपयोग रासायनिक संवेदन में गैर-तीव्रता आधारित माप बनाने के लिए किया जा सकता है।[5]
नाप
प्रतिदीप्ति-आजीवन छवि द्वारा निर्धारित प्रत्येक पिक्सेल की तीव्रता के साथ छवियां प्राप्त होती हैं, जो अलग-अलग प्रतिदीप्ति क्षय दर वाली पदार्थो के बीच अंतर देखने की अनुमति देता है (तथापि वे पदार्थ बिल्कुल समान तरंग दैर्ध्य पर प्रतिदीप्त हों), और ऐसी छवियां भी उत्पन्न करती हैं जो अन्य क्षय मार्गों में परिवर्तन दिखाती हैं, जैसे कि प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण में है।
स्पंदित प्रकाश
स्पंदित स्रोत का उपयोग करते समय डोमेन में प्रतिदीप्ति जीवन काल निर्धारित किया जा सकता है।
जब फ्लोरोफोरस की आबादी प्रकाश की एक अल्ट्राशॉर्ट या डिराक डेल्टा कार्य पल्स द्वारा उत्साहित होती है, तो समय-समाधान प्रतिदीप्ति ऊपर वर्णित अनुसार तेजी से क्षय हो जाएगा। चूँकि, अगर उत्तेजना नाड़ी या पता लगाने की प्रतिक्रिया व्यापक है, मापा फ्लोरेसेंस, डी (टी), पूरी तरह से घातीय नहीं होगा। वाद्य प्रतिक्रिया कल्पना, आईआरएफ(t) दृढ़ संकल्प होगा या क्षय कार्य , F(t) के साथ मिश्रित किया जाएगा।
स्रोत, संसूचक और इलेक्ट्रॉनिक्स की वाद्य प्रतिक्रिया को सामान्यतः बिखरे हुए उत्तेजना प्रकाश से मापा जा सकता है। क्षय फलन (और संबंधित जीवनकाल) को पुनर्प्राप्त करना अतिरिक्त चुनौतियों का सामना करता है क्योंकि आवृत्ति डोमेन में विभाजन उच्च ध्वनि उत्पन्न करता है जब भाजक शून्य के समीप होता है।
टीसीएसपीसी
समय-सहसंबंधित एकल-फोटॉन गणना (टीसीएसपीसी) सामान्यतः नियोजित होती है क्योंकि यह स्रोत तीव्रता और एकल फोटॉन पल्स आयाम में भिन्नता के लिए क्षतिपूर्ति करती है।
व्यावसायिक टीसीएसपीसी उपकरण का उपयोग करके एक प्रतिदीप्ति क्षय वक्र को 405 fs तक के समय प्रस्ताव के साथ सूची किया जा सकता है।[citation needed] [6]
दर्ज प्रतिदीप्ति क्षय हिस्टोग्राम पोइसन वितरण का पालन करता है जिसे फिटिंग के समय फिट की अच्छाई का निर्धारण करने में माना जाता है।
अधिक विशेष रूप से, टीसीएसपीसी उत्तेजना लेजर पल्स के संबंध में एक तेज एकल-फोटॉन संसूचक (सामान्यतः एक फोटो-मल्टीप्लायर ट्यूब (फोटोमल्टीप्लायर) या एक फोटॉन हिमस्खलन फोटो डायोड (एसपीएडी)) द्वारा अलग-अलग फोटोन का पता लगाने के समय को सूची करता है।
रिकॉर्डिंग कई लेजर स्पंद के लिए दोहराई जाती है और पर्याप्त सूची की गई घटनाओं के बाद, इन सभी सूची किए गए समय बिंदुओं में घटनाओं की संख्या का हिस्टोग्राम बनाने में सक्षम होता है।
यह हिस्टोग्राम तब एक घातांकीय कार्यन के लिए फिट हो सकता है जिसमें ब्याज का घातांकीय आजीवन क्षय कार्य होता है, और आजीवन पैरामीटर तदनुसार निकाला जा सकता है।
16 से 64 तत्वों वाले मल्टी-चैनल पीएमटी प्रणाली व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं,[7] जबकि वर्तमान में प्रदर्शित सीएमओएस एकल-फोटॉन हिमस्खलन डायोड (एसपीएडी)-टीसीएसपीसी फ़्लिम प्रणाली अधिक संख्या में डिटेक्शन चैनल और अतिरिक्त कम लागत वाले विकल्प प्रदान कर सकते हैं।[8]
गेटिंग विधि
पल्स उत्तेजना अभी भी इस विधि में प्रयोग किया जाता है। स्पंद के नमूने तक पहुंचने से पहले, कुछ प्रकाश एक डाइक्रोइक दर्पण द्वारा परावर्तित होता है और फोटोडायोड द्वारा पता लगाया जाता है जो सीसीडी संसूचक के सामने स्थित एक गेटेड प्रकाशीय तीव्रता (जीओआई) को नियंत्रित करने वाले विलंब जनरेटर को सक्रिय करता है। भारत सरकार केवल उस समय के अंश का पता लगाने की अनुमति देती है जब यह देरी के बाद खुला होता है। इस प्रकार, एक समायोज्य देरी जनरेटर के साथ, एक नमूना के प्रतिदीप्ति क्षय की समय सीमा को सम्मिलित करते हुए कई विलंब समय के बाद प्रतिदीप्ति उत्सर्जन एकत्र करने में सक्षम है।[9][10] वर्तमान के वर्षों में एकीकृत सघन सीसीडी कैमरों ने बाजार में प्रवेश किया है। इन कैमरों में एक छवि गहनता, सीसीडी सेंसर और एक एकीकृत विलंब जनरेटर सम्मिलित है। कम से कम 200ps के गेटिंग समय वाले सीसीडी कैमरे और 10ps के विलंब चरण उप-नैनोसेकंड प्रस्ताव फ़्लिम की अनुमति देते हैं। एंडोस्कोप के संयोजन में इस विधि का उपयोग ब्रेन ट्यूमर के अंतर शल्य चिकित्सा निदान के लिए किया जाता है।[11]
चरण मॉडुलन
चरण-मॉड्यूलेशन विधि द्वारा आवृत्ति डोमेन में प्रतिदीप्ति जीवन काल निर्धारित किया जा सकता है। विधि एक ऐसे प्रकाश स्रोत का उपयोग करती है जो उच्च आवृत्ति (500 मेगाहर्ट्ज तक) पर स्पंदित या संशोधित होता है, जैसे कि एक एलईडी, डायोड लेजर या एक ध्वनिक-प्रकाशिकी न्यूनाधिक या एक ध्वनि-प्रकाशिकी मॉड्यूलेटर के साथ संयुक्त एक सतत तरंग स्रोत। प्रतिदीप्ति है (ए।) विमॉडुलित और (बी।) चरण स्थानांतरित; दोनों मात्राएँ फ्लोरोफोर के विशिष्ट क्षय समय से संबंधित हैं। इसके अलावा, उत्तेजना और प्रतिदीप्ति साइन तरंगों के y-घटकों को संशोधित किया जाएगा, और इन y-घटकों के मॉडुलन अनुपात से जीवनकाल निर्धारित किया जा सकता है। इसलिए, जीवन भर के लिए 2 मान चरण-मॉड्यूलेशन विधि से निर्धारित किए जा सकते हैं। जीवनकाल इन प्रायोगिक मापदंडों की उपयुक्त प्रक्रियाओं के माध्यम से निर्धारित किया जाता है। पीएमटी-आधारित या कैमरा-आधारित आवृत्ति डोमेन फ़्लिम का लाभ इसकी तेज़ आजीवन छवि अधिग्रहण है, जो इसे लाइव सेल अनुसंधान जैसे अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त बनाता है।[12]
विश्लेषण
विश्लेषण एल्गोरिथम का लक्ष्य मापा क्षय से शुद्ध क्षय वक्र को निकालना और जीवनकाल (ओं) का अनुमान लगाना है। उत्तरार्द्ध सामान्यतः एकल या बहु घातीय कार्यों को फिट करके पूरा किया जाता है। इस समस्या को हल करने के लिए कई तरह के तरीके विकसित किए गए हैं। सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि कम से कम वर्ग पुनरावृत्ति पुन: कनवल्शन है जो अवशिष्टों के भारित योग को कम करने पर आधारित है। इस विधि में सैद्धांतिक घातीय क्षय वक्रों को उपकरण प्रतिक्रिया कार्य के साथ जटिल किया जाता है, जिसे अलग से मापा जाता है, और सबसे अच्छा फिट अलग-अलग इनपुट के लिए अवशिष्टों की पुनरावृत्त गणना द्वारा पाया जाता है जब तक कि न्यूनतम नहीं मिल जाता। टिप्पणियों के एक सेट के लिए समय बिन i में प्रतिदीप्ति संकेत का, आजीवन अनुमान निम्न के न्यूनतमकरण द्वारा किया जाता है:
प्रयोगात्मक कठिनाइयों के अलावा, तरंग दैर्ध्य पर निर्भर साधन प्रतिक्रिया समारोह सहित, पुनरावृत्त डी-कनवॉल्यूशन समस्या का गणितीय उपचार सीधे आगे नहीं है और यह एक धीमी प्रक्रिया है जो फ़्लिम के शुरुआती दिनों में पिक्सेल-दर-पिक्सेल विश्लेषण के लिए अव्यावहारिक बना दिया। गैर-फिटिंग तरीके आकर्षक हैं क्योंकि वे जीवन भर के आकलन के लिए बहुत तेज़ समाधान प्रदान करते हैं। इस श्रेणी की प्रमुख और सीधी तकनीकों में से एक रैपिड आजीवन निर्धारण (आरएलडी) विधि है। RLD क्षय वक्र को समान चौड़ाई के दो भागों में विभाजित करके जीवन काल और उनके आयामों की सीधे गणना करता है टी। समान समय अंतराल में क्षय वक्र को एकीकृत करके विश्लेषण किया जाता है टी:
Ii, i-वें चैनल में सूची किया गया संकेत है और K चैनलों की संख्या है। जीवनकाल का अनुमान लगाया जा सकता है:
बहुघातीय क्षयों के लिए यह समीकरण औसत जीवनकाल प्रदान करता है। द्वि-घातीय क्षय का विश्लेषण करने के लिए इस विधि का विस्तार किया जा सकता है। इस पद्धति का एक बड़ा दोष यह है कि यह उपकरण प्रतिक्रिया प्रभाव को ध्यान में नहीं रख सकता है और इस कारण विश्लेषण में मापा क्षय घटता के प्रारंभिक भाग को अनदेखा किया जाना चाहिए। इसका मतलब है कि सिग्नल का हिस्सा खारिज कर दिया गया है और छोटे जीवनकाल का अनुमान लगाने की सटीकता कम हो जाती है।
कनवल्शन प्रमेय की दिलचस्प विशेषताओं में से एक यह है कि कनवल्शन का इंटीग्रल उन कारकों का उत्पाद है जो इंटीग्रल बनाते हैं। ऐसी कुछ तकनीकें हैं जो रूपांतरित स्थान में काम करती हैं जो मापी गई वक्र से शुद्ध क्षय वक्र को पुनर्प्राप्त करने के लिए इस गुण का उपयोग करती हैं। लागुएरे गॉस विस्तार के साथ लाप्लास और फूरियर परिवर्तन का उपयोग रूपांतरित अंतरिक्ष में जीवनकाल का अनुमान लगाने के लिए किया गया है। ये दृष्टिकोण विसंक्रमण आधारित विधियों की तुलना में तेज़ हैं लेकिन वे ट्रंकेशन और नमूनाकरण समस्याओं से पीड़ित हैं। इसके अलावा, लैगुएरे गॉस विस्तार जैसी विधियों का अनुप्रयोग गणितीय रूप से जटिल है। फूरियर विधियों में एकल घातीय क्षय वक्र का जीवनकाल निम्न द्वारा दिया जाता है:
जहाँ :
और n हार्मोनिक संख्या है और T पता लगाने की कुल समय सीमा है।
अनुप्रयोग
फ़्लिम मुख्य रूप से जीव विज्ञान में कोशिकाओं और ट्यूमर में फोटोसेंसिटाइज़र का पता लगाने के साथ-साथ उन मामलों में FRET के रूप में उपयोग किया जाता है जहां रतिमितीय छवि मुश्किल है। इस विधि को 1980 के दशक के अंत और 1990 के दशक की शुरुआत में विकसित किया गया था (गेटिंग विधि: बुगेल एट अल। 1989। कोनिग 1989,[13] चरण मॉडुलन: Lakowicz एट अल। 1992,[14][15]) 1990 के दशक के अंत में अधिक व्यापक रूप से लागू होने से पहले। सेल कल्चर में, इसका उपयोग ईजीएफ रिसेप्टर सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए किया गया है[16] और तस्करी।[17] टाइम डोमेन फ़्लिम (tdFLIM) का उपयोग परमाणु लिफाफे में अलग-अलग होमोपोलिमर्स में दोनों प्रकार के परमाणु मध्यवर्ती फिलामेंट प्रोटीन विटामिन ए और बी 1 की बातचीत को दिखाने के लिए किया गया है, जो उच्च क्रम संरचनाओं में एक दूसरे के साथ बातचीत करते हैं।[18] फ़्लिम छवि विशेष रूप से न्यूरॉन्स में उपयोगी है, जहां मस्तिष्क के ऊतकों द्वारा प्रकाश का बिखरना रतिमितीय छवि के लिए समस्याग्रस्त है।[19] न्यूरॉन्स में, स्पंदित प्रकाश का उपयोग करते हुए फ़्लिम छवि का उपयोग रास (प्रोटीन) का अध्ययन करने के लिए किया गया है,[20] CaMKII, Rac (GTPase), और रैन[21] पारिवारिक प्रोटीन। फ़्लिम का उपयोग इंट्राडर्मल कैंसर कोशिकाओं के साथ-साथ फार्मास्युटिकल और कॉस्मेटिक यौगिकों का पता लगाने के लिए क्लिनिकल मल्टीफ़ोटो टोमोग्राफी में किया गया है।
वर्तमान में फ़्लिम का उपयोग पादप कोशिकाओं में फ्लेवनॉल्स का पता लगाने के लिए भी किया गया है।[22]
ऑटोफ्लोरोसेंट कोएंजाइम निकोटिनामाइड एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड |एनएडी(पी)एच और फ्लेविन एडेनिन डायन्यूक्लियोटाइड[23]
स्तनधारी चयापचय में परिवर्तन के लिए मार्कर के रूप में कोफ़ेक्टर (जैव रसायन) से ऑटो-प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए मल्टी-फोटॉन फ़्लिम का तेजी से उपयोग किया जाता है।[24]
झल्लाहट इमेजिंग
चूंकि एक फ्लोरोफोर का प्रतिदीप्ति जीवनकाल विकिरण (यानी प्रतिदीप्ति) और गैर-विकिरण (यानी शमन, FRET) दोनों प्रक्रियाओं पर निर्भर करता है, दाता अणु से स्वीकर्ता अणु में ऊर्जा हस्तांतरण दाता के जीवनकाल को कम कर देगा। इस प्रकार, फ़्लिम का उपयोग कर झल्लाहट माप फ्लोरोफोर के राज्यों/वातावरणों के बीच भेदभाव करने के लिए एक विधि प्रदान कर सकता है।[25] तीव्रता-आधारित FRET मापों के विपरीत, FLIM-आधारित FRET माप भी फ्लोरोफोरस की सांद्रता के प्रति असंवेदनशील होते हैं और इस प्रकार नमूना भर में एकाग्रता और उत्सर्जन तीव्रता में भिन्नता द्वारा पेश की गई कलाकृतियों को फ़िल्टर कर सकते हैं।
यह भी देखें
- प्रतिदीप्ति जीवनकाल और वर्णक्रमीय छवि के लिए फेजर दृष्टिकोण
संदर्भ
- ↑ Nakabayashi, Takakazu; Wang, Hui-Ping; Kinjo, Masataka; Ohta, Nobuhiro (4 June 2008). "इंट्रासेल्यूलर पीएच मापन के लिए बढ़ी हुई हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग का अनुप्रयोग". Photochemical & Photobiological Sciences (in English). 7 (6): 668–670. doi:10.1039/B800391B. ISSN 1474-9092. PMID 18528549.
- ↑ Levitt, James A.; Kuimova, Marina K.; Yahioglu, Gokhan; Chung, Pei-Hua; Suhling, Klaus; Phillips, David (9 July 2009). "मेम्ब्रेन-बाउंड मॉलिक्यूलर रोटर्स फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में चिपचिपाहट को मापते हैं". The Journal of Physical Chemistry C. 113 (27): 11634–11642. doi:10.1021/jp9013493. hdl:10044/1/15590. ISSN 1932-7447. S2CID 96097931.
- ↑ Ruedas-Rama, Maria J.; Orte, Angel; Hall, Elizabeth A. H.; Alvarez-Pez, Jose M.; Talavera, Eva M. (20 February 2012). "टाइम-सॉल्युड फ्लोरीमेट्री और फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग के लिए क्लोराइड आयन नैनोसेंसर". Analyst (in English). 137 (6): 1500–1508. Bibcode:2012Ana...137.1500R. doi:10.1039/C2AN15851E. ISSN 1364-5528. PMID 22324050.
- ↑ Agronskaia, Alexandra V.; Tertoolen, L.; Gerritsen, Hans C. (November 2004). "जीवित कोशिकाओं में कैल्शियम की फास्ट फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग". Journal of Biomedical Optics. 9 (6): 1230–1237. Bibcode:2004JBO.....9.1230A. doi:10.1117/1.1806472. ISSN 1083-3668. PMID 15568944.
- ↑ Joseph R. Lakowicz. Principles of Fluorescence Spectroscopy 3rd edition. Springer (2006). ISBN 978-0387-31278-1.[page needed]
- ↑ "SPC-150NX, Product description". Becker & Hickl. Becker & Hickl GmbH. April 26, 2017. Retrieved April 26, 2017.
- ↑ "PML-16, Product description". Becker & Hickl. Becker & Hickl GmbH. April 26, 2017. Retrieved April 26, 2017.
- ↑ Li, Day-Uei; Arlt, Jochen; Richardson, Justin; Walker, Richard; Buts, Alex; Stoppa, David; Charbon, Edoardo; Henderson, Robert (2010). "Real-time fluorescence lifetime imaging system with a 32 × 32 0.13μm CMOS low dark-count single-photon avalanche diode array". Optics Express. 18 (10): 10257–69. Bibcode:2010OExpr..1810257L. doi:10.1364/OE.18.010257. PMID 20588879.
- ↑ Chang, CW; Sud, D; Mycek, MA (2007). प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग माइक्रोस्कोपी. Methods in Cell Biology. Vol. 81. pp. 495–524. doi:10.1016/S0091-679X(06)81024-1. ISBN 9780123740250. PMID 17519182.
- ↑ Elson, D. S.; Munro, I; Requejo-Isidro, J; McGinty, J; Dunsby, C; Galletly, N; Stamp, G W; Neil, M A A; Lever, M J; Kellett, P A; Dymoke-Bradshaw, A; Hares, J; French, P M W (2004). "सेगमेंटेड ऑप्टिकल इमेज इंटेंसिफायर के साथ सिंगल-शॉट अधिग्रहण सहित रीयल-टाइम टाइम-डोमेन फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग". New Journal of Physics. 6 (1): 180. Bibcode:2004NJPh....6..180E. doi:10.1088/1367-2630/6/1/180.
- ↑ Sun, Yinghua; Hatami, Nisa; Yee, Matthew; Marcu, Jennifer; Elson, Daniel S.; Gorin, Fredric; Schrot, Rudolph J.; Phipps, Laura (2010). "ब्रेन ट्यूमर इमेज-गाइडेड सर्जरी के लिए फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी" (PDF). Journal of Biomedical Optics. 15 (5): 056022–056022–5. Bibcode:2010JBO....15e6022S. doi:10.1117/1.3486612. PMC 2966493. PMID 21054116.
- ↑ Gadella, T.W.J., editor, FRET and FLIM techniques. Elsevier, 2009 https://books.google.com/books/about/FRET_and_FLIM_Techniques.html?id=uHvqu4hLhH8C&redir_esc=y[page needed]
- ↑ Oida, T.; Sako, Y; Kusumi, A (1993). "प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (फ्लिमस्कोपी)। एकल कोशिकाओं में एंडोसोम फ्यूजन के अध्ययन के लिए कार्यप्रणाली विकास और अनुप्रयोग". Biophysical Journal. 64 (3): 676–85. Bibcode:1993BpJ....64..676O. doi:10.1016/S0006-3495(93)81427-9. PMC 1262380. PMID 8471720.
- ↑ Lakowicz, Joseph R.; Szmacinski, Henryk; Nowaczyk, Kazimierz; Berndt, Klaus W.; Johnson, Michael (1992). "प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग". Analytical Biochemistry. 202 (2): 316–30. doi:10.1016/0003-2697(92)90112-K. PMC 6986422. PMID 1519759.
- ↑ Lakowicz, Joseph R.; Szmacinski, H; Nowaczyk, K; Johnson, ML (1992). "फ्री और प्रोटीन-बाउंड एनएडीएच की फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4): 1271–5. Bibcode:1992PNAS...89.1271L. doi:10.1073/pnas.89.4.1271. PMC 48431. PMID 1741380.
- ↑ Wouters, Fred S.; Bastiaens, Philippe I.H. (1999). "कोशिकाओं में रिसेप्टर टाइरोसिन किनसे गतिविधि की प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग". Current Biology. 9 (19): 1127–30. doi:10.1016/S0960-9822(99)80484-9. PMID 10531012. S2CID 7640970.
- ↑ Verveer, Peter J.; Wouters, FS; Reynolds, AR; Bastiaens, PI (2000). "प्लाज्मा झिल्ली में पार्श्व ErbB1 रिसेप्टर सिग्नल प्रसार की मात्रात्मक इमेजिंग". Science. 290 (5496): 1567–70. Bibcode:2000Sci...290.1567V. doi:10.1126/science.290.5496.1567. PMID 11090353.
- ↑ Delbarre, Erwan; Tramier, Marc; Coppey-Moisan, Maïté; Gaillard, Claire; Courvalin, Jean-Claude; Buendia, Brigitte (2006). "The truncated prelamin A in Hutchinson–Gilford progeria syndrome alters segregation of A-type and B-type lamin homopolymers" (PDF). Human Molecular Genetics. 15 (7): 1113–1122. doi:10.1093/hmg/ddl026. PMID 16481358.
- ↑ Yasuda, Ryohei (2006). "प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण और प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके न्यूरोनल सिग्नलिंग के स्पोटियोटेम्पोरल गतिकी का इमेजिंग". Current Opinion in Neurobiology. 16 (5): 551–61. doi:10.1016/j.conb.2006.08.012. PMID 16971112. S2CID 54398436.
- ↑ Harvey, Christopher D.; Yasuda, R; Zhong, H; Svoboda, K (2008). "एकल वृक्ष के समान रीढ़ की सक्रियता से शुरू हुई रास गतिविधि का प्रसार". Science. 321 (5885): 136–40. Bibcode:2008Sci...321..136H. doi:10.1126/science.1159675. PMC 2745709. PMID 18556515.
- ↑ Kaláb, Petr; Soderholm, Jon (2010). "The design of Förster (fluorescence) resonance energy transfer (FRET)-based molecular sensors for Ran GTPase". Methods. 51 (2): 220–32. doi:10.1016/j.ymeth.2010.01.022. PMC 2884063. PMID 20096786.
- ↑ Mueller-Harvey, Irene; Feucht, Walter; Polster, Juergen; Trnková, Lucie; Burgos, Pierre; Parker, Anthony W.; Botchway, Stanley W. (2012). "फ्लेवनॉल्स के परमाणु संघ का पता लगाने के लिए पिको-सेकंड प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग के साथ दो-फोटॉन उत्तेजना". Analytica Chimica Acta. 719: 68–75. doi:10.1016/j.aca.2011.12.068. PMID 22340533. S2CID 24094780.
- ↑ Cao, Ruofan; Wallrabe, Horst; Siller, Karsten; Periasamy, Ammasi (2020-02-05). "कोशिकाओं और ऊतकों में ऑटो-फ्लोरोसेंट एनएडी (पी) एच और एफएडी के लिए एफएलआईएम इमेजिंग, फिटिंग और विश्लेषण का अनुकूलन". Methods and Applications in Fluorescence. 8 (2): 024001. Bibcode:2020MApFl...8b4001C. doi:10.1088/2050-6120/ab6f25. ISSN 2050-6120. PMID 31972557. S2CID 210883495.
- ↑ Datta, Rupsa; Alfonso-García, Alba; Cinco, Rachel; Gratton, Enrico (2015-05-20). "ऑक्सीडेटिव तनाव के अंतर्जात बायोमार्कर की प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग". Scientific Reports (in English). 5 (1): 9848. doi:10.1038/srep09848. ISSN 2045-2322. PMC 4438616. PMID 25993434.
- ↑ Becker, Wolfgang; Bergmann, Axel (2003). "ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के लिए लाइफटाइम इमेजिंग तकनीक" (PDF). p. 4.
बाहरी संबंध
- Fluorescence Excited-State Lifetime Imaging
- Lifetime and spectral analysis tools in ImageJ: http://spechron.com Archived 2013-03-11 at the Wayback Machine
- Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
- Principle of टीसीएसपीसी फ़्लिम (Becker&Hickl GmbH)