प्रतिदीप्ति-आजीवन इमेजिंग माइक्रोस्कोपी

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फ्लोरेसेंस-आजीवन छवि माइक्रोस्कोपी या फ़्लिम एक छवि विधि है जो एक नमूने से फ्लोरोफोरे के फोटॉन उत्सर्जन की घातीय क्षय दर में अंतर पर आधारित है। इसे संनाभि माइक्रोस्कोपी, दो फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी और मल्टीफोटोन टोमोग्राफी में छवि विधि के रूप में उपयोग किया जा सकता है।

फ़्लोरोफ़ोर की प्रकाश आजीवन (एफएलटी), इसकी तीव्रता के अतिरिक्त , फ़्लिम में छवि बनाने के लिए उपयोग की जाती है। प्रतिदीप्ति जीवनकाल फ्लोरोफोर के स्थानीय सूक्ष्म पर्यावरण पर निर्भर करता है, इस प्रकार प्रकाश स्रोत, पृष्ठभूमि प्रकाश की तीव्रता या सीमित फोटो-विरंजन की चमक में परिवर्तन के कारण प्रतिदीप्ति तीव्रता में किसी भी गलत माप को रोकता है। इस विधि में नमूने की मोटी परतों में फोटॉन के प्रकीर्णन के प्रभाव को कम करने का भी लाभ है। सूक्ष्म पर्यावरण आजीवन माप पर निर्भर होने के कारण पीएच श्यानता और रासायनिक प्रजातियों की एकाग्रता के लिए एक संकेतक के रूप में उपयोग किया गया है |

प्रतिदीप्ति जीवनकाल

एक फ्लोरोफोर जो एक फोटॉन द्वारा उत्साहित अवस्था है, कई अलग-अलग (विकिरण और/या गैर-विकिरण) क्षय मार्गों के माध्यम से क्षय दर के आधार पर एक निश्चित संभावना के साथ समतल अवस्था में गिर जाएगा। प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करने के लिए, इनमें से एक मार्ग एक फोटॉन के स्वतःस्फूर्त उत्सर्जन द्वारा होना चाहिए। सांख्यिकीय पहनावा विवरण में, उत्सर्जित प्रतिदीप्ति समय के अनुसार क्षय हो जाएगी

$I(t)=I_{0}e^{-t/\tau }$

जहाँ

${\frac {1}{\tau }}=\sum k_{i}$.

ऊपरोक्त में, $t$ यह समय है, $\tau$ प्रतिदीप्ति जीवनकाल है, $I_{0}$ $t=0$ पर प्रारंभिक प्रतिदीप्ति है, और $k_{i}$ प्रत्येक क्षय पथ के लिए दरें हैं, जिनमें से कम से कम एक प्रतिदीप्ति क्षय दर होनी चाहिए $k_{f}$. इससे भी महत्वपूर्ण बात, जीवन भर, $\tau$ प्रारंभिक तीव्रता और उत्सर्जित प्रकाश से स्वतंत्र है। इसका उपयोग रासायनिक संवेदन में गैर-तीव्रता आधारित माप बनाने के लिए किया जा सकता है।

नाप

प्रतिदीप्ति-आजीवन छवि $\tau$ द्वारा निर्धारित प्रत्येक पिक्सेल की तीव्रता के साथ छवियां प्राप्त होती हैं, जो अलग-अलग प्रतिदीप्ति क्षय दर वाली पदार्थो के बीच अंतर देखने की अनुमति देता है (तथापि वे पदार्थ बिल्कुल समान तरंग दैर्ध्य पर प्रतिदीप्त हों), और ऐसी छवियां भी उत्पन्न करती हैं जो अन्य क्षय मार्गों में परिवर्तन दिखाती हैं, जैसे कि प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण में है।

स्पंदित प्रकाश

स्पंदित स्रोत का उपयोग करते समय डोमेन में प्रतिदीप्ति जीवन काल निर्धारित किया जा सकता है।

जब फ्लोरोफोरस की आबादी प्रकाश की एक अल्ट्राशॉर्ट या डिराक डेल्टा कार्य पल्स द्वारा उत्साहित होती है, तो समय-समाधान प्रतिदीप्ति ऊपर वर्णित अनुसार तेजी से क्षय हो जाएगा। चूँकि, अगर उत्तेजना नाड़ी या पता लगाने की प्रतिक्रिया व्यापक है, मापा फ्लोरेसेंस, डी (टी), पूरी तरह से घातीय नहीं होगा। वाद्य प्रतिक्रिया कल्पना, आईआरएफ(t) दृढ़ संकल्प होगा या क्षय कार्य , F(t) के साथ मिश्रित किया जाएगा।

${d}(t)={IRF}(t)\otimes {F}(t)$

स्रोत, संसूचक और इलेक्ट्रॉनिक्स की वाद्य प्रतिक्रिया को सामान्यतः बिखरे हुए उत्तेजना प्रकाश से मापा जा सकता है। क्षय फलन (और संबंधित जीवनकाल) को पुनर्प्राप्त करना अतिरिक्त चुनौतियों का सामना करता है क्योंकि आवृत्ति डोमेन में विभाजन उच्च ध्वनि उत्पन्न करता है जब भाजक शून्य के समीप होता है।

टीसीएसपीसी

समय-सहसंबंधित एकल-फोटॉन गणना (टीसीएसपीसी) सामान्यतः नियोजित होती है क्योंकि यह स्रोत तीव्रता और एकल फोटॉन पल्स आयाम में भिन्नता के लिए क्षतिपूर्ति करती है।

व्यावसायिक टीसीएसपीसी उपकरण का उपयोग करके एक प्रतिदीप्ति क्षय वक्र को 405 fs तक के समय प्रस्ताव के साथ सूची किया जा सकता है।

दर्ज प्रतिदीप्ति क्षय हिस्टोग्राम पोइसन वितरण का पालन करता है जिसे फिटिंग के समय फिट की अच्छाई का निर्धारण करने में माना जाता है।

अधिक विशेष रूप से, टीसीएसपीसी उत्तेजना लेजर पल्स के संबंध में एक तेज एकल-फोटॉन संसूचक (सामान्यतः एक फोटो-मल्टीप्लायर ट्यूब (फोटोमल्टीप्लायर) या एक फोटॉन हिमस्खलन फोटो डायोड (एसपीएडी)) द्वारा अलग-अलग फोटोन का पता लगाने के समय को सूची करता है।

रिकॉर्डिंग कई लेजर स्पंद के लिए दोहराई जाती है और पर्याप्त सूची की गई घटनाओं के बाद, इन सभी सूची किए गए समय बिंदुओं में घटनाओं की संख्या का हिस्टोग्राम बनाने में सक्षम होता है।

यह हिस्टोग्राम तब एक घातांकीय कार्यन के लिए फिट हो सकता है जिसमें ब्याज का घातांकीय आजीवन क्षय कार्य होता है, और आजीवन पैरामीटर तदनुसार निकाला जा सकता है।

16 से 64 तत्वों वाले बहु -चैनल पीएमटी प्रणाली व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जबकि वर्तमान में प्रदर्शित सीएमओएस एकल-फोटॉन हिमस्खलन डायोड (एसपीएडी)-टीसीएसपीसी फ़्लिम प्रणाली अधिक संख्या में डिटेक्शन चैनल और अतिरिक्त कम लागत वाले विकल्प प्रदान कर सकते हैं।

गेटिंग विधि

पल्स उत्तेजना अभी भी इस विधि में प्रयोग किया जाता है। स्पंद के नमूने तक पहुंचने से पहले, कुछ प्रकाश एक डाइक्रोइक दर्पण द्वारा परावर्तित होता है और फोटोडायोड द्वारा पता लगाया जाता है जो सीसीडी संसूचक के सामने स्थित एक गेटेड प्रकाशीय तीव्रता (जीओआई) को नियंत्रित करने वाले विलंब जनरेटर को सक्रिय करता है। भारत सरकार केवल उस समय के अंश का पता लगाने की अनुमति देती है जब यह देरी के बाद खुला होता है। इस प्रकार, एक समायोज्य देरी जनरेटर के साथ, एक नमूना के प्रतिदीप्ति क्षय की समय सीमा को सम्मिलित करते हुए कई विलंब समय के बाद प्रतिदीप्ति उत्सर्जन एकत्र करने में सक्षम है। वर्तमान के वर्षों में एकीकृत सघन सीसीडी कैमरों ने बाजार में प्रवेश किया है। इन कैमरों में एक छवि गहनता, सीसीडी सेंसर और एक एकीकृत विलंब जनरेटर सम्मिलित है। कम से कम 200ps के गेटिंग समय वाले सीसीडी कैमरे और 10ps के विलंब चरण उप-नैनोसेकंड प्रस्ताव फ़्लिम की अनुमति देते हैं। एंडोस्कोप के संयोजन में इस विधि का उपयोग ब्रेन ट्यूमर के अंतर शल्य चिकित्सा निदान के लिए किया जाता है।

चरण मॉडुलन

चरण-मॉड्यूलेशन विधि द्वारा आवृत्ति डोमेन में प्रतिदीप्ति जीवन काल निर्धारित किया जा सकता है। विधि एक ऐसे प्रकाश स्रोत का उपयोग करती है जो उच्च आवृत्ति (500 मेगाहर्ट्ज तक) पर स्पंदित या संशोधित होता है, जैसे कि एक एलईडी, डायोड लेजर या एक ध्वनिक-प्रकाशिकी न्यूनाधिक या एक ध्वनि-प्रकाशिकी मॉड्यूलेटर के साथ संयुक्त एक सतत तरंग स्रोत। प्रतिदीप्ति है (ए।) विमॉडुलित और (बी।) चरण स्थानांतरित; दोनों मात्राएँ फ्लोरोफोर के विशिष्ट क्षय समय से संबंधित हैं। इसके अतिरिक्त , उत्तेजना और प्रतिदीप्ति साइन तरंगों के y-घटकों को संशोधित किया जाएगा, और इन y-घटकों के मॉडुलन अनुपात से जीवनकाल निर्धारित किया जा सकता है। इसलिए, जीवन भर के लिए 2 मान चरण-मॉड्यूलेशन विधि से निर्धारित किए जा सकते हैं। जीवनकाल इन प्रायोगिक मापदंडों की उपयुक्त प्रक्रियाओं के माध्यम से निर्धारित किया जाता है। पीएमटी-आधारित या कैमरा-आधारित आवृत्ति डोमेन फ़्लिम का लाभ इसकी तेज़ आजीवन छवि अधिग्रहण है, जो इसे लाइव सेल अनुसंधान जैसे अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त बनाता है।

विश्लेषण

विश्लेषण एल्गोरिथम का लक्ष्य मापा क्षय से शुद्ध क्षय वक्र को निकालना और जीवनकाल (ओं) का अनुमान लगाना है। उत्तरार्द्ध सामान्यतः एकल या बहु घातीय कार्यों को फिट करके पूरा किया जाता है। इस समस्या को हल करने के लिए कई तरह के विधि विकसित किए गए हैं। सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि कम से कम वर्ग पुनरावृत्ति पुन: दृढ़ संकल्प है जो अवशिष्टों के भारित योग को कम करने पर आधारित है। इस विधि में सैद्धांतिक घातीय क्षय वक्रों को उपकरण प्रतिक्रिया कार्य के साथ जटिल किया जाता है, जिसे अलग से मापा जाता है, और सबसे अच्छा फिट अलग-अलग इनपुट के लिए अवशिष्टों की पुनरावृत्त गणना द्वारा पाया जाता है जब तक कि न्यूनतम नहीं मिल जाता है । टिप्पणियों के समूह के लिए $d({{t}_{i}})$ समय बिन i में प्रतिदीप्ति संकेत का, आजीवन अनुमान निम्न के न्यूनतमकरण द्वारा किया जाता है:

${{\chi }^{2}}=\sum \limits _{i}{{\left[{{d}_{i}}({{t}_{i}})-{{d}_{0i}}({{t}_{i}},a,\tau )\right]}^{2}}$

प्रयोगात्मक कठिनाइयों के अतिरिक्त , तरंग दैर्ध्य पर निर्भर साधन प्रतिक्रिया समारोह सहित, पुनरावृत्त डी-दृढ़ संकल्प समस्या का गणितीय उपचार सीधे आगे नहीं है और यह एक धीमी प्रक्रिया है जो फ़्लिम के प्रारंभिक दिनों में पिक्सेल-दर-पिक्सेल विश्लेषण के लिए अव्यावहारिक बना दिया।

गैर-फिटिंग विधि आकर्षक हैं क्योंकि वे जीवन भर के आकलन के लिए बहुत तेज़ समाधान प्रदान करते हैं। इस श्रेणी की प्रमुख और सीधी विधि में से एक रैपिड आजीवन निर्धारण (आरएलडी) विधि है। आरएलडी क्षय वक्र को समान चौड़ाई $\delta$t के दो भागों में विभाजित करके जीवन काल और उनके आयामों की सीधे गणना करता है। समान समय अंतराल $\delta$t में क्षय वक्र को एकीकृत करके विश्लेषण किया जाता है :

${\begin{matrix}{{D}_{0}}=\sum \limits _{i=1}^{K/2}{{{I}_{i}}\delta t}&{{D}_{1}}=\sum \limits _{i=K/2}^{K}{{{I}_{i}}\delta t}\\\end{matrix}}$

Ii, i-वें चैनल में सूची किया गया संकेत है और K चैनलों की संख्या है। जीवनकाल का अनुमान लगाया जा सकता है:

$\tau =\delta t/\ln({{D}_{0}}/{{D}_{1}})$

बहुघातीय क्षयों के लिए यह समीकरण औसत जीवनकाल प्रदान करता है। द्वि-घातीय क्षय का विश्लेषण करने के लिए इस विधि का विस्तार किया जा सकता है। इस पद्धति का एक बड़ा दोष यह है कि यह उपकरण प्रतिक्रिया प्रभाव को ध्यान में नहीं रख सकता है और इस कारण विश्लेषण में मापा क्षय घटता के प्रारंभिक भाग को अनदेखा किया जाना चाहिए। इसका अर्थ है कि एकल का भाग खारिज कर दिया गया है और छोटे जीवनकाल का अनुमान लगाने की स्पष्टता कम हो जाती है।

दृढ़ संकल्प प्रमेय की दिलचस्प विशेषताओं में से एक यह है कि दृढ़ संकल्प का अभिन्न उन कारकों का उत्पाद है जो अभिन्नब नाते हैं। ऐसी कुछ विधि हैं जो रूपांतरित स्थान में काम करती हैं जो मापी गई वक्र से शुद्ध क्षय वक्र को पुनर्प्राप्त करने के लिए इस गुण का उपयोग करती हैं। लागुएरे गॉस विस्तार के साथ लाप्लास और फूरियर परिवर्तन का उपयोग रूपांतरित अंतरिक्ष में जीवनकाल का अनुमान लगाने के लिए किया गया है। ये दृष्टिकोण विसंक्रमण आधारित विधियों की तुलना में तेज़ हैं किंतु वे ट्रंकेशन और नमूनाकरण समस्याओं से पीड़ित हैं। इसके अतिरिक्त , लैगुएरे गॉस विस्तार जैसी विधियों का अनुप्रयोग गणितीय रूप से जटिल है। फूरियर विधियों में एकल घातीय क्षय वक्र का जीवनकाल निम्न द्वारा दिया जाता है:

$\tau ={\frac {1}{n\omega }}{\frac {{A}_{n}}{{B}_{n}}}$

जहाँ :

${\begin{matrix}{{A}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\sin(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF(t)\sin(n\omega t)}}}={\frac {\omega \tau }{1+{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&{{B}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\cos(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF\cos(n\omega t)}}}={\frac {1}{1+n{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&\omega ={\frac {2\pi }{T}}\\\end{matrix}}$

और n हार्मोनिक संख्या है और T पता लगाने की कुल समय सीमा है।

अनुप्रयोग

फ़्लिम मुख्य रूप से जीव विज्ञान में कोशिकाओं और ट्यूमर में फोटोसेंसिटाइज़र का पता लगाने के साथ-साथ उन मामलों में एफआरईटी के रूप में उपयोग किया जाता है जहां रतिमितीय छवि मुश्किल है।

इस विधि को 1980 के दशक के अंत और 1990 के दशक की प्रारंभ में विकसित किया गया था (गेटिंग विधि: बुगेल एट अल। 1989। कोनिग 1989, चरण मॉडुलन: कोविज़ए ट अल। 1992,) 1990 के दशक के अंत में अधिक व्यापक रूप से प्रारंभ होने से पहले। सेल कल्चर में, इसका उपयोग ईजीएफ ग्राही संकेतनका अध्ययन करने के लिए किया गया है और अवैध व्यापार। टाइम डोमेन फ़्लिम (टीडी फ़्लिम ) का उपयोग परमाणु लिफाफे में अलग-अलग होमोपोलिमर्स में दोनों प्रकार के परमाणु मध्यवर्ती फिलामेंट प्रोटीन विटामिन ए और बी 1 की सहभागिता को दिखाने के लिए किया गया है, जो उच्च क्रम संरचनाओं में एक दूसरे के साथ बातचीत करते हैं। फ़्लिम छवि विशेष रूप से न्यूरॉन्स में उपयोगी है, जहां मस्तिष्क के ऊतकों द्वारा प्रकाश का बिखरना रतिमितीय छवि के लिए समस्याग्रस्त है। न्यूरॉन्स में, स्पंदित प्रकाश का उपयोग करते हुए फ़्लिम छवि का उपयोग रास (प्रोटीन) का अध्ययन करने के लिए किया गया है, सीएएमकेआईआई,, आरएसी(जीटीपीएएस), और रैन पारिवारिक प्रोटीन। फ़्लिम का उपयोग अंतर्त्वचीय कैंसर कोशिकाओं के साथ-साथ फार्मास्युटिकल और कॉस्मेटिक यौगिकों का पता लगाने के लिए नैदानिक मल्टीफ़ोटो टोमोग्राफी में किया गया है।

वर्तमान में फ़्लिम का उपयोग पादप कोशिकाओं में फ्लेवनॉल्स का पता लगाने के लिए भी किया गया है।

ऑटोफ्लोरोसेंट कोएंजाइम निकोटिनामाइड एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड |एनएडी(पी)एच और फ्लेविन एडेनिन डायन्यूक्लियोटाइड

स्तनपायी उपापचय में परिवर्तन के लिए मार्कर के रूप में सहकारक (जैव रसायन) से ऑटो-प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए बहु -फोटॉन फ़्लिम का तेजी से उपयोग किया जाता है।

एफआरईटी छवि

चूंकि एक फ्लोरोफोर का प्रतिदीप्ति जीवनकाल विकिरण (जिससे प्रतिदीप्ति) और गैर-विकिरण (जिससे शमन, एफआरईटी) दोनों प्रक्रियाओं पर निर्भर करता है, दाता अणु से स्वीकर्ता अणु में ऊर्जा हस्तांतरण दाता के जीवनकाल को कम कर देगा।

इस प्रकार, फ़्लिम का उपयोग कर एफआरईटी माप फ्लोरोफोर के स्तरों/वातावरणों के बीच अंतर करने के लिए एक विधि प्रदान कर सकता है। तीव्रता-आधारित एफआरईटी मापों के विपरीत, फ़्लिम -आधारित एफआरईटी माप भी फ्लोरोफोरस की सांद्रता के प्रति असंवेदनशील होते हैं और इस प्रकार नमूना भर में एकाग्रता और उत्सर्जन तीव्रता में भिन्नता द्वारा प्रस्तुत की गई कलाकृतियों को छनन कर सकते हैं।

यह भी देखें

• प्रतिदीप्ति जीवनकाल और वर्णक्रमीय छवि के लिए फेजर दृष्टिकोण |

बाहरी संबंध

• Fluorescence Excited-State Lifetime Imaging
• Lifetime and spectral analysis tools in ImageJ: http://spechron.com Archived 2013-03-11 at the Wayback Machine
• Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
• Principle of टीसीएसपीसी फ़्लिम (Becker&Hickl GmbH)