प्रतिदीप्ति-आजीवन इमेजिंग माइक्रोस्कोपी

"FLIM" redirects here. For other uses, see Flim.

फ्लोरेसेंस-लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी या FLIM एक इमेजिंग तकनीक है जो एक नमूने से फ्लोरोफोरे के फोटॉन उत्सर्जन की घातीय क्षय दर में अंतर पर आधारित है। इसे संनाभि माइक्रोस्कोपी, दो फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी और मल्टीफोटोन टोमोग्राफी में इमेजिंग तकनीक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

फ़्लोरोफ़ोर की रोशनी लाइफ़टाइम (FLT), इसकी तीव्रता के बजाय, FLIM में छवि बनाने के लिए उपयोग की जाती है। प्रतिदीप्ति जीवनकाल फ्लोरोफोर के स्थानीय सूक्ष्म पर्यावरण पर निर्भर करता है, इस प्रकार प्रकाश स्रोत, पृष्ठभूमि प्रकाश की तीव्रता या सीमित फोटो-विरंजन की चमक में परिवर्तन के कारण प्रतिदीप्ति तीव्रता में किसी भी गलत माप को रोकता है। इस तकनीक में नमूने की मोटी परतों में फोटॉन के प्रकीर्णन के प्रभाव को कम करने का भी लाभ है। सूक्ष्म-पर्यावरण पर निर्भर होने के कारण, पीएच के संकेतक के रूप में आजीवन मापन का उपयोग किया गया है, श्यानता और रासायनिक प्रजातियों की एकाग्रता।

प्रतिदीप्ति जीवनकाल

एक फ्लोरोफोर जो एक फोटॉन द्वारा उत्साहित अवस्था है, कई अलग-अलग (विकिरण और/या गैर-विकिरण) क्षय मार्गों के माध्यम से क्षय दर के आधार पर एक निश्चित संभावना के साथ जमीनी अवस्था में गिर जाएगा। प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करने के लिए, इनमें से एक मार्ग एक फोटॉन के स्वतःस्फूर्त उत्सर्जन द्वारा होना चाहिए। सांख्यिकीय पहनावा विवरण में, उत्सर्जित प्रतिदीप्ति समय के अनुसार क्षय हो जाएगी

$I(t)=I_{0}e^{-t/\tau }$

कहाँ

${\frac {1}{\tau }}=\sum k_{i}$.

ऊपरोक्त में, $t$ यह समय है, $\tau$ प्रतिदीप्ति जीवनकाल है, $I_{0}$ पर प्रारंभिक प्रतिदीप्ति है $t=0$, और $k_{i}$ प्रत्येक क्षय पथ के लिए दरें हैं, जिनमें से कम से कम एक प्रतिदीप्ति क्षय दर होनी चाहिए $k_{f}$. इससे भी महत्वपूर्ण बात, जीवन भर, $\tau$ प्रारंभिक तीव्रता और उत्सर्जित प्रकाश से स्वतंत्र है। इसका उपयोग रासायनिक संवेदन में गैर-तीव्रता आधारित माप बनाने के लिए किया जा सकता है।

नाप

प्रतिदीप्ति-आजीवन इमेजिंग द्वारा निर्धारित प्रत्येक पिक्सेल की तीव्रता के साथ छवियां प्राप्त होती हैं $\tau$, जो अलग-अलग प्रतिदीप्ति क्षय दर वाली सामग्रियों के बीच कंट्रास्ट देखने की अनुमति देता है (भले ही वे सामग्रियां बिल्कुल समान तरंग दैर्ध्य पर प्रतिदीप्त हों), और ऐसी छवियां भी पैदा करती हैं जो अन्य क्षय मार्गों में परिवर्तन दिखाती हैं, जैसे कि प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण में।

स्पंदित रोशनी

स्पंदित स्रोत का उपयोग करके समय डोमेन में प्रतिदीप्ति जीवन काल निर्धारित किया जा सकता है। जब फ्लोरोफोरस की आबादी प्रकाश की एक अल्ट्राशॉर्ट या डिराक डेल्टा समारोह पल्स द्वारा उत्साहित होती है, तो समय-समाधान प्रतिदीप्ति ऊपर वर्णित अनुसार तेजी से क्षय हो जाएगा। हालांकि, अगर उत्तेजना नाड़ी या पता लगाने की प्रतिक्रिया व्यापक है, मापा फ्लोरेसेंस, डी (टी), पूरी तरह से घातीय नहीं होगा। इंस्ट्रूमेंटल रिस्पांस फंक्शन, IRF(t) कनवल्शन होगा या क्षय फंक्शन, F(t) के साथ मिश्रित होगा।

${d}(t)={IRF}(t)\otimes {F}(t)$ स्रोत, डिटेक्टर और इलेक्ट्रॉनिक्स की वाद्य प्रतिक्रिया को आमतौर पर बिखरे हुए उत्तेजना प्रकाश से मापा जा सकता है। क्षय फलन (और संबंधित जीवनकाल) को पुनर्प्राप्त करना अतिरिक्त चुनौतियों का सामना करता है क्योंकि आवृत्ति डोमेन में विभाजन उच्च शोर पैदा करता है जब भाजक शून्य के करीब होता है।

टीसीएसपीसी

समय-सहसंबंधित एकल-फोटॉन गणना (TCSPC) आमतौर पर नियोजित होती है क्योंकि यह स्रोत तीव्रता और एकल फोटॉन पल्स एम्पलीट्यूड में भिन्नता के लिए क्षतिपूर्ति करती है। व्यावसायिक TCSPC उपकरण का उपयोग करके एक प्रतिदीप्ति क्षय वक्र को 405 fs तक के समय रिज़ॉल्यूशन के साथ रिकॉर्ड किया जा सकता है। दर्ज प्रतिदीप्ति क्षय हिस्टोग्राम पोइसन वितरण का पालन करता है जिसे फिटिंग के दौरान फिट की अच्छाई का निर्धारण करने में माना जाता है। अधिक विशेष रूप से, TCSPC उत्तेजना लेजर पल्स के संबंध में एक तेज सिंगल-फोटॉन डिटेक्टर (आमतौर पर एक फोटो-मल्टीप्लायर ट्यूब (फोटोमल्टीप्लायर) या एक फोटॉन हिमस्खलन फोटो डायोड (SPAD)) द्वारा अलग-अलग फोटोन का पता लगाने के समय को रिकॉर्ड करता है। रिकॉर्डिंग कई लेजर दालों के लिए दोहराई जाती है और पर्याप्त रिकॉर्ड की गई घटनाओं के बाद, इन सभी रिकॉर्ड किए गए समय बिंदुओं में घटनाओं की संख्या का हिस्टोग्राम बनाने में सक्षम होता है। यह हिस्टोग्राम तब एक एक्सपोनेंशियल फ़ंक्शन के लिए फिट हो सकता है जिसमें ब्याज का एक्सपोनेंशियल लाइफ़टाइम क्षय फ़ंक्शन होता है, और लाइफ़टाइम पैरामीटर तदनुसार निकाला जा सकता है। 16 के साथ मल्टी-चैनल पीएमटी सिस्टम से 64 तत्व व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जबकि हाल ही में प्रदर्शित CMOS सिंगल-फोटॉन हिमस्खलन डायोड (SPAD)-TCSPC FLIM सिस्टम अधिक संख्या में डिटेक्शन चैनल और अतिरिक्त कम लागत वाले विकल्प प्रदान कर सकते हैं।

गेटिंग विधि

पल्स उत्तेजना अभी भी इस विधि में प्रयोग किया जाता है। स्पंद के नमूने तक पहुंचने से पहले, कुछ प्रकाश एक डाइक्रोइक दर्पण द्वारा परावर्तित होता है और एक फोटोडायोड द्वारा पता लगाया जाता है जो सीसीडी डिटेक्टर के सामने स्थित एक गेटेड ऑप्टिकल इंटेंसिफायर (जीओआई) को नियंत्रित करने वाले विलंब जनरेटर को सक्रिय करता है। भारत सरकार केवल उस समय के अंश का पता लगाने की अनुमति देती है जब यह देरी के बाद खुला होता है। इस प्रकार, एक समायोज्य देरी जनरेटर के साथ, एक नमूना के प्रतिदीप्ति क्षय की समय सीमा को शामिल करते हुए कई विलंब समय के बाद प्रतिदीप्ति उत्सर्जन एकत्र करने में सक्षम है। हाल के वर्षों में एकीकृत सघन सीसीडी कैमरों ने बाजार में प्रवेश किया है। इन कैमरों में एक छवि गहनता, सीसीडी सेंसर और एक एकीकृत विलंब जनरेटर शामिल है। कम से कम 200ps के गेटिंग समय वाले ICCD कैमरे और 10ps के विलंब चरण उप-नैनोसेकंड रिज़ॉल्यूशन FLIM की अनुमति देते हैं। एंडोस्कोप के संयोजन में इस तकनीक का उपयोग ब्रेन ट्यूमर के अंतर्गर्भाशयी निदान के लिए किया जाता है।

चरण मॉडुलन

चरण-मॉड्यूलेशन विधि द्वारा आवृत्ति डोमेन में प्रतिदीप्ति जीवन काल निर्धारित किया जा सकता है। विधि एक ऐसे प्रकाश स्रोत का उपयोग करती है जो उच्च आवृत्ति (500 मेगाहर्ट्ज तक) पर स्पंदित या संशोधित होता है, जैसे कि एक एलईडी, डायोड लेजर या एक ध्वनिक-ऑप्टिक न्यूनाधिक या एक ध्वनि-ऑप्टिक मॉड्यूलेटर के साथ संयुक्त एक सतत तरंग स्रोत। प्रतिदीप्ति है (ए।) डिमॉड्युलेटेड और (बी।) चरण स्थानांतरित; दोनों मात्राएँ फ्लोरोफोर के विशिष्ट क्षय समय से संबंधित हैं। इसके अलावा, उत्तेजना और प्रतिदीप्ति साइन तरंगों के y-घटकों को संशोधित किया जाएगा, और इन y-घटकों के मॉडुलन अनुपात से जीवनकाल निर्धारित किया जा सकता है। इसलिए, जीवन भर के लिए 2 मान चरण-मॉड्यूलेशन विधि से निर्धारित किए जा सकते हैं। जीवनकाल इन प्रायोगिक मापदंडों की उपयुक्त प्रक्रियाओं के माध्यम से निर्धारित किया जाता है। PMT-आधारित या कैमरा-आधारित फ़्रीक्वेंसी डोमेन FLIM का एक लाभ इसकी तेज़ आजीवन छवि अधिग्रहण है, जो इसे लाइव सेल अनुसंधान जैसे अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त बनाता है।

विश्लेषण

विश्लेषण एल्गोरिथम का लक्ष्य मापा क्षय से शुद्ध क्षय वक्र को निकालना और जीवनकाल (ओं) का अनुमान लगाना है। उत्तरार्द्ध आमतौर पर एकल या बहु घातीय कार्यों को फिट करके पूरा किया जाता है। इस समस्या को हल करने के लिए कई तरह के तरीके विकसित किए गए हैं। सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक कम से कम वर्ग पुनरावृत्ति पुन: कनवल्शन है जो अवशिष्टों के भारित योग को कम करने पर आधारित है। इस तकनीक में सैद्धांतिक घातीय क्षय वक्रों को उपकरण प्रतिक्रिया फ़ंक्शन के साथ जटिल किया जाता है, जिसे अलग से मापा जाता है, और सबसे अच्छा फिट अलग-अलग इनपुट के लिए अवशिष्टों की पुनरावृत्त गणना द्वारा पाया जाता है जब तक कि न्यूनतम नहीं मिल जाता। टिप्पणियों के एक सेट के लिए $d({{t}_{i}})$ समय बिन i में प्रतिदीप्ति संकेत का, आजीवन अनुमान निम्न के न्यूनतमकरण द्वारा किया जाता है:

${{\chi }^{2}}=\sum \limits _{i}{{\left[{{d}_{i}}({{t}_{i}})-{{d}_{0i}}({{t}_{i}},a,\tau )\right]}^{2}}$ प्रयोगात्मक कठिनाइयों के अलावा, तरंग दैर्ध्य पर निर्भर साधन प्रतिक्रिया समारोह सहित, पुनरावृत्त डी-कनवॉल्यूशन समस्या का गणितीय उपचार सीधे आगे नहीं है और यह एक धीमी प्रक्रिया है जो FLIM के शुरुआती दिनों में पिक्सेल-दर-पिक्सेल विश्लेषण के लिए अव्यावहारिक बना दिया। गैर-फिटिंग तरीके आकर्षक हैं क्योंकि वे जीवन भर के आकलन के लिए बहुत तेज़ समाधान प्रदान करते हैं। इस श्रेणी की प्रमुख और सीधी तकनीकों में से एक रैपिड लाइफटाइम निर्धारण (आरएलडी) विधि है। RLD क्षय वक्र को समान चौड़ाई के दो भागों में विभाजित करके जीवन काल और उनके आयामों की सीधे गणना करता है $\delta$टी। समान समय अंतराल में क्षय वक्र को एकीकृत करके विश्लेषण किया जाता है $\delta$टी:

${\begin{matrix}{{D}_{0}}=\sum \limits _{i=1}^{K/2}{{{I}_{i}}\delta t}&{{D}_{1}}=\sum \limits _{i=K/2}^{K}{{{I}_{i}}\delta t}\\\end{matrix}}$ Ii, i-वें चैनल में रिकॉर्ड किया गया संकेत है और K चैनलों की संख्या है। जीवनकाल का अनुमान लगाया जा सकता है:

$\tau =\delta t/\ln({{D}_{0}}/{{D}_{1}})$ बहुघातीय क्षयों के लिए यह समीकरण औसत जीवनकाल प्रदान करता है। द्वि-घातीय क्षय का विश्लेषण करने के लिए इस विधि का विस्तार किया जा सकता है। इस पद्धति का एक बड़ा दोष यह है कि यह उपकरण प्रतिक्रिया प्रभाव को ध्यान में नहीं रख सकता है और इस कारण विश्लेषण में मापा क्षय घटता के प्रारंभिक भाग को अनदेखा किया जाना चाहिए। इसका मतलब है कि सिग्नल का हिस्सा खारिज कर दिया गया है और छोटे जीवनकाल का अनुमान लगाने की सटीकता कम हो जाती है।

कनवल्शन प्रमेय की दिलचस्प विशेषताओं में से एक यह है कि कनवल्शन का इंटीग्रल उन कारकों का उत्पाद है जो इंटीग्रल बनाते हैं। ऐसी कुछ तकनीकें हैं जो रूपांतरित स्थान में काम करती हैं जो मापी गई वक्र से शुद्ध क्षय वक्र को पुनर्प्राप्त करने के लिए इस गुण का उपयोग करती हैं। लागुएरे गॉस विस्तार के साथ लाप्लास और फूरियर परिवर्तन का उपयोग रूपांतरित अंतरिक्ष में जीवनकाल का अनुमान लगाने के लिए किया गया है। ये दृष्टिकोण विसंक्रमण आधारित विधियों की तुलना में तेज़ हैं लेकिन वे ट्रंकेशन और नमूनाकरण समस्याओं से पीड़ित हैं। इसके अलावा, लैगुएरे गॉस विस्तार जैसी विधियों का अनुप्रयोग गणितीय रूप से जटिल है। फूरियर विधियों में एकल घातीय क्षय वक्र का जीवनकाल निम्न द्वारा दिया जाता है:

$\tau ={\frac {1}{n\omega }}{\frac {{A}_{n}}{{B}_{n}}}$ कहाँ:

${\begin{matrix}{{A}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\sin(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF(t)\sin(n\omega t)}}}={\frac {\omega \tau }{1+{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&{{B}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\cos(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF\cos(n\omega t)}}}={\frac {1}{1+n{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&\omega ={\frac {2\pi }{T}}\\\end{matrix}}$ और n हार्मोनिक संख्या है और T पता लगाने की कुल समय सीमा है।

अनुप्रयोग

FLIM मुख्य रूप से जीव विज्ञान में कोशिकाओं और ट्यूमर में फोटोसेंसिटाइज़र का पता लगाने के साथ-साथ उन मामलों में FRET के रूप में उपयोग किया जाता है जहां रतिमितीय इमेजिंग मुश्किल है। इस तकनीक को 1980 के दशक के अंत और 1990 के दशक की शुरुआत में विकसित किया गया था (गेटिंग विधि: बुगेल एट अल। 1989। कोनिग 1989, चरण मॉडुलन: Lakowicz एट अल। 1992,) 1990 के दशक के अंत में अधिक व्यापक रूप से लागू होने से पहले। सेल कल्चर में, इसका उपयोग ईजीएफ रिसेप्टर सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए किया गया है और तस्करी। टाइम डोमेन FLIM (tdFLIM) का उपयोग परमाणु लिफाफे में अलग-अलग होमोपोलिमर्स में दोनों प्रकार के परमाणु मध्यवर्ती फिलामेंट प्रोटीन विटामिन ए और बी 1 की बातचीत को दिखाने के लिए किया गया है, जो उच्च क्रम संरचनाओं में एक दूसरे के साथ बातचीत करते हैं। FLIM इमेजिंग विशेष रूप से न्यूरॉन्स में उपयोगी है, जहां मस्तिष्क के ऊतकों द्वारा प्रकाश का बिखरना रतिमितीय इमेजिंग के लिए समस्याग्रस्त है। न्यूरॉन्स में, स्पंदित रोशनी का उपयोग करते हुए FLIM इमेजिंग का उपयोग रास (प्रोटीन) का अध्ययन करने के लिए किया गया है, CaMKII, Rac (GTPase), और रैन पारिवारिक प्रोटीन। FLIM का उपयोग इंट्राडर्मल कैंसर कोशिकाओं के साथ-साथ फार्मास्युटिकल और कॉस्मेटिक यौगिकों का पता लगाने के लिए क्लिनिकल मल्टीफ़ोटो टोमोग्राफी में किया गया है।

हाल ही में FLIM का उपयोग पादप कोशिकाओं में फ्लेवनॉल्स का पता लगाने के लिए भी किया गया है।

ऑटोफ्लोरोसेंट कोएंजाइम निकोटिनामाइड एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड |एनएडी(पी)एच और फ्लेविन एडेनिन डायन्यूक्लियोटाइड

स्तनधारी चयापचय में परिवर्तन के लिए मार्कर के रूप में कोफ़ेक्टर (जैव रसायन) से ऑटो-प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए मल्टी-फोटॉन FLIM का तेजी से उपयोग किया जाता है।

झल्लाहट इमेजिंग

चूंकि एक फ्लोरोफोर का प्रतिदीप्ति जीवनकाल विकिरण (यानी प्रतिदीप्ति) और गैर-विकिरण (यानी शमन, FRET) दोनों प्रक्रियाओं पर निर्भर करता है, दाता अणु से स्वीकर्ता अणु में ऊर्जा हस्तांतरण दाता के जीवनकाल को कम कर देगा। इस प्रकार, FLIM का उपयोग कर झल्लाहट माप फ्लोरोफोर के राज्यों/वातावरणों के बीच भेदभाव करने के लिए एक विधि प्रदान कर सकता है। तीव्रता-आधारित FRET मापों के विपरीत, FLIM-आधारित FRET माप भी फ्लोरोफोरस की सांद्रता के प्रति असंवेदनशील होते हैं और इस प्रकार नमूना भर में एकाग्रता और उत्सर्जन तीव्रता में भिन्नता द्वारा पेश की गई कलाकृतियों को फ़िल्टर कर सकते हैं।

यह भी देखें

• प्रतिदीप्ति जीवनकाल और वर्णक्रमीय इमेजिंग के लिए फेजर दृष्टिकोण

बाहरी संबंध

• Fluorescence Excited-State Lifetime Imaging
• Lifetime and spectral analysis tools in ImageJ: http://spechron.com Archived 2013-03-11 at the Wayback Machine
• Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
• Principle of TCSPC FLIM (Becker&Hickl GmbH)