दो-हाइब्रिड स्क्रीनिंग

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दो-हाइब्रिड परख का अवलोकन, दो प्रोटीनों के बीच परस्पर क्रियाओं की जाँच करना, जिसे यहाँ बैट और प्री कहा जाता है।
'A' जीएएल4 ट्रांसक्रिप्शन फ़ैक्टर जीन रिपोर्टर जीन (LacZ) के ट्रांसक्रिप्शन के लिए आवश्यक दो-डोमेन प्रोटीन (बीडी और एडी) उत्पन्न करता है।
'B', 'C' दो संलयन प्रोटीन तैयार किए जाते हैं: जीएएल4बीडी+बैत और जीएएल4एडी+शिकार। उनमें से कोई भी सामान्यतः अकेले प्रतिलेखन (रिपोर्टर जीन का) आरंभ करने के लिए पर्याप्त नहीं है।
'D' जब दोनों संलयन प्रोटीन का उत्पादन होता है 'और' पहले संलयन प्रोटीन का बैट हिस्सा दूसरे के शिकार भाग के साथ संपर्क करता है, तो रिपोर्टर जीन का प्रतिलेखन होता है।

टू-हाइब्रिड स्क्रीनिंग (मूल रूप से यीस्ट टू-हाइब्रिड प्रणाली या वाई2एच के रूप में जाना जाता है) आणविक जीव विज्ञान विधि है। जिसका उपयोग प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रिया (पीपीआई) की खोज के लिए किया जाता है।[1] और डीएनए-बाध्यकारी प्रोटीन प्रोटीन-डीएनए परस्पर क्रिया प्रोटीन-डीएनए परस्पर क्रिया [2][3] क्रमशः दो प्रोटीन या डीएनए अणु के बीच भौतिक अंतःक्रियाओं (जैसे बंधन) के परीक्षण द्वारा होता है।

परीक्षण के पीछे का आधार अपस्ट्रीम सक्रिय करने का क्रम (यूएएस) पर ट्रांसक्रिप्शन कारक के बंधन द्वारा अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम (डीएनए) रिपोर्टर जीन (एस) की सक्रियता है। दो-हाइब्रिड स्क्रीनिंग के लिए, प्रतिलेखन कारक को दो अलग-अलग टुकड़ों में विभाजित किया जाता है। जिसे डीएनए-बाध्यकारी डोमेन (डीबीडी या अधिकांशतः बीडी के रूप में भी संक्षिप्त किया जाता है) और सक्रिय डोमेन (एडी) कहा जाता है। बीडी यूएएस के लिए डीएनए-बाध्यकारी प्रोटीन के लिए उत्तरदायी प्रोटीन डोमेन है और एडी प्रतिलेखन (आनुवांशिकी) आनुवांशिकी) की सक्रियता के लिए उत्तरदायी डोमेन है।[1][2] वाई2एच इस प्रकार प्रोटीन-टुकड़ा पूरकता परख है।

इतिहास

1989 में स्टेनली फील्ड्स (जीवविज्ञानी) और ओके-क्यू सॉन्ग द्वारा अग्रणी, विधि को मूल रूप से यीस्ट सैक्रोमाइसेस सेरेविसी के जीएएल4 ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर का उपयोग करके प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रिया का पता लगाने के लिए रचना किया गया था। गैलेक्टोज उपयोग में सम्मिलित जीन का जीएएल4 प्रोटीन सक्रिय प्रतिलेखन, जिसने चयन का आधार बनाया है।[4] तब से, एक ही सिद्धांत को कई वैकल्पिक विधियों का वर्णन करने के लिए अनुकूलित किया गया है। जिनमें कुछ ऐसे हैं जो प्रोटीन-डीएनए परस्पर क्रिया या डीएनए-डीएनए परस्पर क्रिया का पता लगाते हैं, साथ ही ऐसे विधि जो यीस्ट के अतिरिक्त इशरीकिया कोली या स्तनधारी कोशिकाओं जैसे विभिन्न होस्ट जीवों का उपयोग करते हैं।[3][5]

मूल आधार

दो-हाइब्रिड स्क्रीन की कुंजी यह है कि अधिकांश यूकेरियोटिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों में, सक्रिय और बाध्यकारी डोमेन मॉड्यूलर होते हैं और प्रत्यक्ष बंधन के बिना एक दूसरे के निकट कार्य कर सकते हैं।[6] इसका कारण यह है कि तथापि ट्रांसक्रिप्शन कारक दो टुकड़ों में विभाजित हो, फिर भी यह ट्रांसक्रिप्शन को सक्रिय कर सकता है। जब दो टुकड़े अप्रत्यक्ष रूप से जुड़े होंते है।

सबसे समान्य स्क्रीनिंग दृष्टिकोण यीस्ट दो-संकर परख है। इस दृष्टिकोण में शोधकर्ता जानता है कि प्रयुक्त माध्यम (यदि प्लेट्स) पर प्रत्येक शिकार कहाँ स्थित है। उच्च परिणाम स्क्रीनिंग प्रणाली (अधिकांशतः रोबोट का उपयोग करके) का उपयोग करके नवीनतम दशक में कई जीवों में लाखों संभावित परस्पर क्रिया की जांच की गई है और डेटाबेस में बायोग्रिड के रूप में हजारों परस्पर क्रिया का पता लगाया और वर्गीकृत किया गया है।[7][8] यह प्रणाली अधिकांशतः यीस्ट के जेनेटिक इंजीनियरिंग स्ट्रेन का उपयोग करती है। जिसमें कुछ पोषक तत्वों (सामान्यतः एमिनो एसिड या न्यूक्लिक अम्ल ) के जैव संश्लेषण की कमी होती है। जब इन पोषक तत्वों की कमी वाले मीडिया पर उगाया जाता है, तो यीस्ट जीवित रहने में विफल रहता है। इस उत्परिवर्ती यीस्ट तनाव को प्लाज्मिड के रूप में विदेशी डीएनए को सम्मिलित करने के लिए बनाया जा सकता है। यीस्ट दो-हाइब्रिड स्क्रीनिंग में, अलग-अलग चारा और शिकार प्लास्मिड एक साथ उत्परिवर्ती यीस्ट तनाव में पेश किए जाते हैं या होस्ट सेल में दोनों प्लास्मिड प्राप्त करने के लिए सही रणनीति का उपयोग किया जाता है।[9]

दूसरा उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण लाइब्रेरी स्क्रीनिंग दृष्टिकोण है। इस सेट अप में चारा और शिकार को शरण देने वाली कोशिकाएं यादृच्छिक क्रम में मिलती हैं। चयनात्मक माध्यम पर जीवित कोशिकाओं के मिलन और चयन के बाद वैज्ञानिक अलग-अलग प्लास्मिडों को यह देखने के लिए अनुक्रमित करेंगे कि कौन सा शिकार (डीएनए अनुक्रम) उपयोग किए गए चारा के साथ परस्पर क्रिया कर रहा है। इस दृष्टिकोण में पुनरुत्पादन की दर कम होती है और मैट्रिक्स दृष्टिकोण की तुलना में अधिक मात्रा में गलत सकारात्मकता उत्पन्न होती है।[9]

प्लास्मिड को प्रोटीन उत्पाद बनाने के लिए इंजीनियर किया जाता है जिसमें डीएनए-बाध्यकारी डोमेन (बीडी) खंड को प्रोटीन पर जोड़ा जाता है। जबकि अन्य प्लास्मिड को प्रोटीन उत्पाद बनाने के लिए इंजीनियर किया जाता है। जिसमें सक्रियण डोमेन (एडी) टुकड़ा दूसरे प्रोटीन पर जुड़ा होता है। बीडी से जुड़े प्रोटीन को चारा प्रोटीन के रूप में संदर्भित किया जा सकता है, और सामान्यतः एक ज्ञात प्रोटीन है जिसका उपयोग अन्वेषक नए बाध्यकारी भागीदारों की पहचान करने के लिए कर रहा है। एडी से जुड़े प्रोटीन को शिकार प्रोटीन के रूप में संदर्भित किया जा सकता है और यह या तो एक ज्ञात प्रोटीन या ज्ञात या अज्ञात प्रोटीन का एक लाइब्रेरी (जीव विज्ञान) हो सकता है। इस संदर्भ में, एक लाइब्रेरी में प्रोटीन-एन्कोडिंग अनुक्रमों का संग्रह हो सकता है। जो किसी विशेष जीव या ऊतक में व्यक्त सभी प्रोटीनों का प्रतिनिधित्व करता है, या यादृच्छिक डीएनए अनुक्रमों को संश्लेषित करके उत्पन्न किया जा सकता है।[3] स्रोत के अतिरिक्त, उन्हें बाद में प्लाज्मिड के प्रोटीन-एन्कोडिंग अनुक्रम में सम्मिलित किया जाता है। जिसे बाद में स्क्रीनिंग विधि के लिए चुने गए कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया जाता है।[3] यह विधि , लाइब्रेरी का उपयोग करते समय, मानती है कि प्रत्येक कोशिका को एक से अधिक प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जाता है और इसलिए, प्रत्येक कोशिका अंततः प्रोटीन लाइब्रेरी से एक से अधिक सदस्य को व्यक्त नहीं करती है।

यदि चारा और शिकार प्रोटीन परस्पर क्रिया करते हैं (अर्थात, बाँधते हैं), तो प्रतिलेखन कारक के एडी और बीडी अप्रत्यक्ष रूप से जुड़े होते हैं। एडी को प्रतिलेखन प्रारंभ स्थल के निकट लाते हैं और रिपोर्टर जीन (ओं) का प्रतिलेखन हो सकता है। यदि दो प्रोटीन परस्पर क्रिया नहीं करते हैं, तो रिपोर्टर जीन का कोई प्रतिलेखन नहीं होता है। इस तरह, फ्यूज्ड प्रोटीन के बीच सफल परस्पर क्रिया सेल फेनोटाइप में बदलाव से जुड़ा होता है।[1]

उन कोशिकाओं को अलग करने की चुनौती जो प्रोटीन को व्यक्त करती हैं | जो उनके समकक्ष संलयन प्रोटीन के साथ परस्पर क्रिया करती हैं जो नहीं करती हैं, निम्नलिखित खंड में संबोधित की जाती हैं।

फिक्स्ड डोमेन

किसी भी अध्ययन में, कुछ प्रोटीन डोमेन, जिनकी जांच की जा रही है। अध्ययन के लक्ष्यों के अनुसार अलग-अलग होंगे, जबकि अन्य डोमेन, जिनकी स्वयं जांच नहीं की जा रही है। उन्हें स्थिर रखा जाएगा उदाहरण के लिए, डीएनए-बाध्यकारी डोमेन का चयन करने के लिए दो-हाइब्रिड अध्ययन में, डीएनए-बाध्यकारी डोमेन, बीडी, भिन्न होती है, जबकि दो परस्पर क्रिया करने वाले प्रोटीन, चारा और शिकार को बीडी के बीच शक्तिशाली बंधन बनाए रखने के लिए स्थिर रखा जाना चाहिए। और ई.डी. ऐसे कई डोमेन हैं जिनमें से बीडी, चारा और शिकार और एडी को चुनना है, यदि ये स्थिर रहना है। प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रिया जांच में, बीडी को कई शक्तिशाली डीएनए-बाइंडिंग डोमेन जैसे Zif268 से चुना जा सकता है।[2] चारा और शिकार डोमेन की लगातार पसंद एन 342 वी उत्परिवर्तन के साथ यीस्ट जीएएल11पी के 263-352 अवशेष हैं [2] और यीस्ट जीएएल4 के 58-97 अवशेष,[2] क्रमश इन डोमेन का उपयोग यीस्ट और बैक्टीरिया-आधारित चयन विधि दोनों में किया जा सकता है और इन्हें एक साथ शक्तिशालीी से बाँधने के लिए जाना जाता है।[1][2]

चुने गए एडी को सेल की अपनी ट्रांसक्रिप्शन मशीनरी का उपयोग करके रिपोर्टर जीन के ट्रांसक्रिप्शन को सक्रिय करने में सक्षम होना चाहिए। इस प्रकार, यीस्ट-आधारित विधि में उपयोग के लिए उपलब्ध विभिन्न प्रकार के विज्ञापन उनके जीवाणु-आधारित एनालॉग्स में उपयोग करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकते हैं। दाद सिंप्लेक्स वायरस-व्युत्पन्न एडी, वीपी16 और यीस्ट जीएएल4 एडी का उपयोग यीस्ट में सफलता के साथ किया गया है।[1] ई. कोलाई आरएनए पोलीमरेज़ के α-सबयूनिट के एक भाग का उपयोग ई. कोलाई-आधारित विधियों में किया गया है।[2][3]

जबकि शक्तिशाली रूप से सक्रिय करने वाले डोमेन अशक्त परस्पर क्रिया के प्रति अधिक संवेदनशीलता की अनुमति दे सकते हैं | इसके विपरीत, अशक्त एडी अधिक कठोरता प्रदान कर सकता है।

अभिव्यक्ति प्लास्मिड्स का निर्माण

दो-संकर विश्लेषण या इसकी व्युत्पन्न विधि में से एक को करने के लिए कई इंजीनियर आनुवंशिक अनुक्रमों को होस्ट सेल में सम्मिलित किया जाना चाहिए। इन अनुक्रमों के निर्माण और वितरण में उपयोग किए जाने वाले विचार और विधि परख की आवश्यकताओ और प्रायोगिक पृष्ठभूमि के रूप में चुने गए जीव के अनुसार भिन्न होते हैं।

हाइब्रिड लाइब्रेरी की दो व्यापक श्रेणियां हैं | रैंडम लाइब्रेरी और सीडीएनए-आधारित लाइब्रेरी सीडीएनए लाइब्रेरी का निर्माण सीडीएनए द्वारा किया जाता है। जो सेल के विशिष्ट प्रकार के सेल से एकत्रित एमआरएनए के रिवर्स प्रतिलेखन के माध्यम से उत्पन्न होता है। इस लाइब्रेरी को एक निर्माण में जोड़ा जा सकता है। जिससे यह परख में उपयोग होने वाले बीडी या एडी से जुड़ा होता है।[1] यादृच्छिक लाइब्रेरी इन सीडीएनए वर्गों के स्थान पर यादृच्छिक अनुक्रम के डीएनए की लंबाई का उपयोग करता है। इन यादृच्छिक अनुक्रमों के उत्पादन के लिए कई विधियाँ उपस्थित हैं | जिनमें साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन कैसेट उत्परिवर्तन सम्मिलित हैं।[2] डीएनए लाइब्रेरी के स्रोत के अतिरिक्त, यह उचित प्रतिबंध एंडोन्यूक्लाइजेस का उपयोग करके प्रासंगिक प्लास्मिड/फाग्मिड में उचित स्थान पर डीएनए लिगेज है।[2]

इ. कोलाई-विशिष्ट विचार

हाइब्रिड प्रोटीनों को आईपीटीजी-प्रेरित करने योग्य लाख प्रमोटरों के नियंत्रण में रखकर, उन्हें केवल आईपीटीजी के साथ पूरक मीडिया पर व्यक्त किया जाता है। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक आनुवंशिक निर्माण में विभिन्न एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीनों को सम्मिलित करके, गैर-रूपांतरित कोशिकाओं के विकास को संबंधित एंटीबायोटिक युक्त मीडिया पर संस्कृति के माध्यम से सरलता से रोका जाता है। यह काउंटर चयन विधियों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। जिसमें सेल अस्तित्व के लिए परस्पर क्रिया की कमी की आवश्यकता होती है।[2]

रिपोर्टर जीन को ई. कोलाई जीनोम में पहले प्रकरण में डालकर डाला जा सकता है। एक प्रकार का प्लास्मिड जिसमें बैक्टीरिया कोशिका जीनोम में स्वयं को सम्मिलित करने की क्षमता होती है।[2] प्रति सेल लगभग एक की प्रतिलिपि संख्या के साथ [10] हाइब्रिड एक्सप्रेशन फाग्मिड्स को ई. कोलाई एक्सएल-1 ब्लू सेल्स में इलेक्ट्रोपोरेट किया जा सकता है। जो वीसीएस-एम13 सहायक फेज के साथ प्रवर्धन और संक्रमण के बाद लाइब्रेरी फेज का स्टॉक उत्पन्न करता है। इन फेज में प्रत्येक में फेजमिड लाइब्रेरी का एक सिंगल-फंसे हुए सदस्य होते है।[2]

प्रोटीन की जानकारी की रिकवरी

एक बार चयन हो जाने के बाद, उपयुक्त विशेषताओं को प्रदर्शित करने वाले प्रोटीन की प्राथमिक संरचना निर्धारित की जानी चाहिए। यह उपयुक्त फेनोटाइप दिखाने वाली कोशिकाओं से प्रोटीन-एन्कोडिंग अनुक्रमों (मूल रूप से सम्मिलित) की पुनर्प्राप्ति द्वारा प्राप्त किया जाता है।

इ. कोलाई

ई. कोलाई कोशिकाओं को बदलने के लिए उपयोग किए जाने वाले फेजिमिड को चयनित कोशिकाओं से वीसीएस-एम13 हेल्पर फेज से संक्रमित करके बचाया जा सकता है। परिणामी फेज कण जो उत्पन्न होते हैं उनमें एकल-फंसे हुए फाग्मिड्स होते हैं और एक्सएल-1 ब्लू कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए उपयोग किया जाता है।[2] बाद में इन एक्सएल-1 ब्लू सेल से डबल-फंसे हुए फाग्मिड्स एकत्र किए जाते हैं, जो मूल लाइब्रेरी फेज का उत्पादन करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया को अनिवार्य रूप से उलट देते हैं। अंत में, डीएनए अनुक्रम डिडॉक्सी अनुक्रमण के माध्यम से निर्धारित किए जाते हैं।[2]

संवेदनशीलता को नियंत्रित करना

एस्चेरिचिया कोलाई-व्युत्पन्न टीईटीआर रिप्रेसर का उपयोग पारंपरिक रिपोर्टर जीन के अनुरूप किया जा सकता है और इसे टेट्रासाइक्लिन या डॉक्सीसाइक्लिन (टीईटी-आर अवरोधक) द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। इस प्रकार टेट-आर की अभिव्यक्ति को मानक दो-हाइब्रिड प्रणाली द्वारा नियंत्रित किया जाता है। किंतु टेट-आर अपने टेट-आर प्रमोटर के माध्यम से एचआईएस3 जैसे पहले उल्लेखित रिपोर्टर की अभिव्यक्ति को नियंत्रित (दमन) करता है। टेट्रासाइक्लिन या इसके डेरिवेटिव का उपयोग टीईटी-आर का उपयोग करने वाली प्रणाली की संवेदनशीलता को विनियमित करने के लिए किया जा सकता है।[1]

संवेदनशीलता को उनके रिपोर्टर जीन पर कोशिकाओं की निर्भरता को अलग करके भी नियंत्रित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह उसकी3-आश्रित कोशिकाओं के विकास माध्यम में हिस्टडीन की सांद्रता को परिवर्तित कर और एडीए आश्रित कोशिकाओं के लिए स्ट्रेप्टोमाइसिन की सांद्रता को परिवर्तित कर प्रभावित हो सकता है।[2][3] चयन-जीन-निर्भरता को उपयुक्त एकाग्रता पर चयन जीन के अवरोधक को प्रयुक्त करके भी नियंत्रित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए 3-अमीनो-1,2,4-ट्राईज़ोल (3-एटी), एचआईएस3-जीन उत्पाद का प्रतिस्पर्धी अवरोधक है और हिस्टडीन की कमी वाले मीडिया पर वृद्धि के लिए आवश्यक एचआईएस3 अभिव्यक्ति के न्यूनतम स्तर को टाइट्रेट करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।[2]

रिपोर्टर डीएनए में ऑपरेटर अनुक्रमों की संख्या को परिवर्तित करके ही संवेदनशीलता को संशोधित किया जा सकता है।

गैर-संलयन प्रोटीन

तीसरा, गैर-संलयन प्रोटीन दो संलयन प्रोटीन के साथ सह-व्यक्त किया जा सकता है। जांच के आधार पर, तीसरा प्रोटीन किसी संलयन प्रोटीन को संशोधित कर सकता है या उनकी परस्पर क्रिया में मध्यस्थता या हस्तक्षेप कर सकता है।[1]

एक या दोनों संलयन प्रोटीन के संशोधन या सक्रियण के लिए तीसरे प्रोटीन की सह-अभिव्यक्ति आवश्यक हो सकती है। उदाहरण के लिए, एस. सेरेविसिया के पास कोई अंतर्जात टाइरोसिन किनेज नहीं है। यदि जांच में प्रोटीन सम्मिलित होता है। जिसके लिए टाइरोसिन फास्फारिलीकरण की आवश्यकता होती है, तो किनेज को टाइरोसिन किनसे जीन के रूप में आपूर्ति की जानी चाहिए।[1]

गैर-संलयन प्रोटीन दोनों संलयन प्रोटीन को एक साथ बांधकर परस्पर क्रिया में मध्यस्थता कर सकता है। जैसा कि लिगैंड-आश्रित रिसेप्टर डिमराइजेशन के स्थिति में होता है।[1]

इंटरेक्टिंग पार्टनर के साथ प्रोटीन के लिए, गैर-संलयन रूप में तीसरे प्रोटीन की आपूर्ति करके अन्य प्रोटीनों के लिए इसकी कार्यात्मक होमोलॉजी का मूल्यांकन किया जा सकता है। जो तब अपने बाध्यकारी भागीदार के लिए फ्यूजन-प्रोटीन के साथ प्रतिस्पर्धा कर सकता है या नहीं कर सकता है। तीसरे प्रोटीन और अन्य संलयन प्रोटीन के बीच बंधन रिपोर्टर अभिव्यक्ति सक्रियण परिसर के गठन को बाधित करेगा और इस प्रकार रिपोर्टर अभिव्यक्ति को कम करेगा, जिससे फेनोटाइप में विशिष्ट परिवर्तन होता है।[1]

स्प्लिट-यूबिकिटिन यीस्ट टू-हाइब्रिड

क्लासिक यीस्ट टू-हाइब्रिड स्क्रीन की सीमा यह है कि वे घुलनशील प्रोटीन तक सीमित हैं। इसलिए अघुलनशील अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के बीच प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए उनका उपयोग करना असंभव है। स्प्लिट-यूबिकिटिन प्रणाली इस सीमा पर आवरण पाने के लिए विधि प्रदान करता है।[11] स्प्लिट-यूबीक्यूटिन प्रणाली में, अध्ययन किए जाने वाले दो इंटीग्रल मेम्ब्रेन प्रोटीन को दो अलग-अलग यूबिकिटिन मोइटीज से जोड़ा जाता है। सी-टर्मिनल यूबिकिटिन मोएटिटी (क्यूब, अवशेष 35-76) और एन-टर्मिनल यूबिकिटिन मौएटिटी (नब, अवशेष 1–34) )। इन मिश्रित प्रोटीनों को क्रमशः चारे और शिकार कहा जाता है। इंटीग्रल मेम्ब्रेन प्रोटीन से जुड़े होने के अतिरिक्त, क्यूब मोएटिटी को ट्रांसक्रिप्शन फ़ैक्टर (टीएफ) से भी जोड़ा जाता है। जिसे यूबिकिटिन विशिष्ट प्रोटीज द्वारा बंद किया जा सकता है। चारा-शिकार की परस्पर क्रिया पर, नब और क्यूब-मोएटीज इकट्ठा होते हैं | विभाजित-सर्वव्यापकता को पुनर्गठित करते हैं। पुनर्गठित स्प्लिट-यूबिकिटिन अणु को यूबिकिटिन विशिष्ट प्रोटीज द्वारा पहचाना जाता है। जो ट्रांसक्रिप्शन कारक को अलग कर देता है। जिससे इसे रिपोर्टर जीन के ट्रांसक्रिप्शन को प्रेरित करने की अनुमति मिलती है।[12]

प्रतिदीप्त दो-संकर परख

ज़ोलघादर और सहकर्मियों ने फ्लोरोसेंट दो-हाइब्रिड प्रणाली प्रस्तुत किया जो दो हाइब्रिड प्रोटीनों का उपयोग करता है। जो विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीनों के साथ-साथ लैसी, लाख दमनकारी से जुड़े होते हैं। संलयन प्रोटीन की संरचना इस तरह दिखती है। एफपी2-लैसी-चारा और एफपी1-शिकार जहां चारा और शिकार प्रोटीन परस्पर क्रिया करते हैं और फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी1 = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन , एफपी2 = एमचेरी) को बंधन स्थल पर निकटता में लाते हैं। होस्ट सेल जीनोम में लैकी प्रोटीन [13] प्रणाली का उपयोग प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रिया के अवरोधकों की जांच के लिए भी किया जा सकता है।[14]

एंजाइमैटिक टू-हाइब्रिड प्रणाली: किस

जबकि मूल वाई2एच प्रणाली ने पुनर्गठित प्रतिलेखन कारक का उपयोग किया था | अन्य प्रणालियाँ पीपीआई का पता लगाने के लिए एंजाइमी गतिविधियाँ बनाती हैं। उदाहरण के लिए, काइनेज सबस्ट्रेट सेंसर (किस), स्तनधारी दो-हाइब्रिड दृष्टिकोण है जिसे इंट्रासेल्युलर पीपीआई को मैप करने के लिए रचना किया गया है। यहां, चारा प्रोटीन को टीवाईके2 के काइनेज युक्त भाग से जोड़ा जाता है और शिकार को gp130 साइटोकिन रिसेप्टर के टुकड़े से जोड़ा जाता है। जब चारा और शिकार आपस में परस्पर क्रिया करते हैं, तो टीवाईके2 शिकार चिमेरा पर स्टेट3 डॉकिंग साइटों को फास्फोराइलेट करता है। जो अंततः रिपोर्टर जीन की सक्रियता की ओर जाता है।[15]

एक-, तीन- और एक-दो-हाइब्रिड संस्करण

एक-संकर

इस विधि की एक-हाइब्रिड भिन्नता प्रोटीन-डीएनए परस्पर क्रिया की जांच करने के लिए रचना की गई है और एकल संलयन प्रोटीन का उपयोग करती है। जिसमें एडी सीधे बाध्यकारी डोमेन से जुड़ा हुआ है। चूंकि इस स्थिति में बाध्यकारी डोमेन दो-हाइब्रिड प्रोटीन-प्रोटीन विश्लेषण के रूप में निश्चित अनुक्रम का जरूरी नहीं है, किंतु लाइब्रेरी द्वारा गठित किया जा सकता है। इस लाइब्रेरी को वांछित लक्ष्य अनुक्रम के विरुद्ध चुना जा सकता है। जो रिपोर्टर जीन निर्माण के प्रवर्तक क्षेत्र में डाला जाता है। सकारात्मक-चयन प्रणाली में, बाध्यकारी डोमेन जो यूएएस को सफलतापूर्वक बांधता है और ट्रांसक्रिप्शन की अनुमति देता है। इस प्रकार चुना जाता है।[1]

ध्यान दें कि डीएनए-बाइंडिंग डोमेन का चयन -हाइब्रिड प्रणाली का उपयोग करके जरूरी नहीं है। किंतु दो-हाइब्रिड प्रणाली का उपयोग करके भी किया जा सकता है। जिसमें बाइंडिंग डोमेन भिन्न होता है और चारा और शिकार प्रोटीन को स्थिर रखा जाता है।[2][3]

तीन-संकर

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तीन-संकर परख का अवलोकन।

दो-संकर विधि के तीन-संकर भिन्नता के माध्यम से आरएनए-प्रोटीन परस्पर क्रिया की जांच की गई है। इस स्थिति में, हाइब्रिड आरएनए अणु दो प्रोटीन संलयन डोमेन को एक साथ जोड़ने का कार्य करता है। जो एक दूसरे के साथ परस्पर क्रिया करने के लिए नहीं किंतु मध्यस्थ आरएनए अणु (उनके आरएनए-बाध्यकारी डोमेन के माध्यम से) के लिए अभिप्रेत है।[1] गैर-संलयन प्रोटीन से जुड़ी विधि जो एक समान कार्य करती हैं, जैसा कि ऊपर 'गैर-संलयन प्रोटीन' खंड में वर्णित है, जिसको तीन-संकर विधियों के रूप में भी संदर्भित किया जा सकता है।

एक-दो-संकर

एक- और दो-हाइब्रिड विधियों का एक साथ उपयोग (अर्थात, एक साथ प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-डीएनए परस्पर क्रिया) एक-दो-हाइब्रिड दृष्टिकोण के रूप में जाना जाता है और स्क्रीन की कठोरता को बढ़ाने की अनुमान है।[1]

होस्ट जीव

चूंकि सैद्धांतिक रूप से, किसी भी जीवित कोशिका को दो-संकर विश्लेषण की पृष्ठभूमि के रूप में उपयोग किया जा सकता है। ऐसे व्यावहारिक विचार हैं जो तय करते हैं कि किसे चुना जाता है। चुनी हुई सेल लाइन अपेक्षाकृत सस्ती और संस्कृति के लिए आसान होनी चाहिए और जांच के विधियों और अभिकर्मकों के आवेदन का सामना करने के लिए पर्याप्त रूप से शक्तिशाली होनी चाहिए।[1] उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग उच्च-थ्रूपुट अध्ययन करने के लिए उत्तरार्द्ध विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। इसलिए यीस्ट एस. सेरेविसिया दो-संकर अध्ययनों के लिए मुख्य होस्ट जीव रहा है। चूंकि यह हमेशा अन्य जीवों से परस्पर क्रिया करने वाले प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए आदर्श प्रणाली नहीं है।[16] यीस्ट कोशिकाओं में अधिकांशतः एक ही पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधन नहीं होते हैं। अलग कोडन का उपयोग होता है या कुछ प्रोटीन की कमी होती है जो प्रोटीन की सही अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण होती हैं। इन समस्याओं से निपटने के लिए कई नए दो-हाइब्रिड प्रणाली विकसित किए गए हैं। उपयोग की गई प्रणाली के आधार पर यदि प्लेट्स या विशिष्ट विकास माध्यम का उपयोग कोशिकाओं को विकसित करने और परस्पर क्रिया के लिए चयन की अनुमति देने के लिए किया जाता है। सबसे समान्य उपयोग की जाने वाली विधि यदि चढ़ाना है जहां कोशिकाओं को चुनिंदा माध्यम पर चढ़ाया जाता है जिससे परस्पर क्रिया हो सकती है। जिन कोशिकाओं में कोई अंतःक्रियात्मक प्रोटीन नहीं है। उन्हें इस चयनात्मक माध्यम पर जीवित नहीं रहना चाहिए।[7][17]

एस. सेरेविसिया (यीस्ट)

यीस्ट एस. सेरेविसिया दो-हाइब्रिड विधि की स्थापना के समय उपयोग किया जाने वाला मॉडल जीव था। इसे सामान्यतः वाई2एच प्रणाली के रूप में जाना जाता है। इसकी कई विशेषताएं हैं जो इसे परस्पर क्रिया की होस्टी करने के लिए शक्तिशाली जीव बनाती हैं। जिसमें तृतीयक प्रोटीन संरचनाओं को बनाने की क्षमता, तटस्थ आंतरिक पीएच, डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड बनाने की बढ़ी हुई क्षमता और अन्य साइटोसोलिक बफर कारकों के बीच कम-राज्य ग्लूटाथियोन सम्मिलित हैं। आंतरिक बनाए रखने के लिए पर्यावरण [1] यीस्ट मॉडल को गैर-आणविक विधि के माध्यम से परिवर्तन किया जा सकता है और इसका पूरा जीनोम अनुक्रम ज्ञात है।[1] यीस्ट प्रणाली विविध कल्चर परिस्थितियों और कठोर रसायनों के प्रति सहिष्णु हैं, जिन्हें स्तनधारी ऊतक संस्कृतियों पर प्रयुक्त नहीं किया जा सकता है।[1]

विशेष रूप से वाई2एच स्क्रीन के लिए कई यीस्ट स्ट्रेन्स बनाए गए हैं, उदाहरण Y187 [18] और एएच109,[19] दोनों तकरा होल्डिंग्स द्वारा निर्मित यीस्ट उपभेदों आर2एचमेट और बीके100 का भी उपयोग किया गया है।[20]

कैंडिडा अल्बिकन्स

कैंडिडा अल्बिकन्स सी अल्बिकैंस विशेष विशेषता वाला यीस्ट है। यह ल्यूसीन के अतिरिक्त सीयूजी कोडन को सेरीन में अनुवादित करता है। इस विभिन्न कोडन उपयोग के कारण सी. अल्बिकैंस जीन का उपयोग करके प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रिया की जांच करने के लिए वाई2एच के रूप में मॉडल प्रणाली एस सेरेविसिया का उपयोग करना कठिन है। अधिक देशी वातावरण प्रदान करने के लिए सी. एल्बीकैंस टू-हाइब्रिड (सी2एच) प्रणाली विकसित की गई थी। इस प्रणाली के साथ प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रियाओं का अध्ययन सी. एल्बीकैंस में ही किया जा सकता है।[21][22] वर्तमानिया जोड़ उच्च-थ्रूपुट प्रणाली का निर्माण था।[23][24][25]

इ. कोलाई

एस्चेरिचिया कोली|ई में सामान्यतः जीवाणु दो संकर विधियाँ (बी2एच या बीटीएच) अपनाई जाती हैं। कोलाई और यीस्ट-आधारित प्रणालियों पर कुछ लाभ हैं। उदाहरण के लिए, उच्च परिवर्तन दक्षता और विकास की तीव्र दर ई. कोली को बड़े लाइब्रेरी (108 से अधिक) के उपयोग के लिए उधार देती है।)[2] प्रोटीन अनुक्रम में सम्मिलित होने के लिए परमाणु स्थानीयकरण संकेत के लिए आवश्यकताओं की अनुपस्थिति और प्रोटीन का अध्ययन करने की क्षमता जो कि यीस्ट के लिए विषाक्त होगी, प्रायोगिक पृष्ठभूमि जीव का चयन करते समय विचार करने के लिए प्रमुख कारक भी हो सकते हैं।[2]

कुछ ई. कोलाई डीएनए मिथाइलट्रांसफेरेज़ प्रोटीन की मेथिलिकरण गतिविधि कुछ डीएनए-बाध्यकारी प्रोटीन चयनों में हस्तक्षेप कर सकती है। यदि यह अनुमान लगाया गया है, तो विशेष मिथाइलट्रांसफेरेज़ के लिए दोषपूर्ण ई. कोलाई स्ट्रेन का उपयोग स्पष्ट समाधान हो सकता है।[2] यूकेरियोटिक प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रिया (जैसे मानव प्रोटीन) का अध्ययन करते समय बी2एच आदर्श नहीं हो सकता है। क्योंकि प्रोटीन यूकेरियोटिक कोशिकाओं की तरह फोल्ड नहीं हो सकता है या अन्य प्रसंस्करण की कमी हो सकती है।

स्तनधारी कोशिकाएं

वर्तमान के वर्षों में स्तनधारी दो संकर (एम2एच) प्रणाली को सेलुलर वातावरण में स्तनधारी प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए रचना किया गया है। जो मूल प्रोटीन वातावरण की बारीकी से नकल करता है।[26] प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रिया खोजने के लिए इस प्रणाली में क्षणिक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट स्तनधारी कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है।[27][28] स्तनधारी प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए स्तनधारी सेल लाइन का उपयोग करने से अधिक मूल संदर्भ में काम करने का लाभ मिलता है।[5] पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों, फॉस्फोराइलेशन, एसाइलेशन और ग्लाइकोसिलेशन समान हैं। यीस्ट दो संकर प्रणाली का उपयोग करने की तुलना में प्रोटीन का इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण भी अधिक सही है।[29][30]

सिग्नल इनपुट का अध्ययन करने के लिए स्तनधारी दो-संकर प्रणाली के साथ भी संभव है।[31]

एक और बड़ा लाभ यह है कि संक्रमण के 48 घंटे के अंदर परिणाम प्राप्त किया जा सकता है।[5]

अरबिडोप्सिस थलियाना

2005 में पौधों में दो संकर प्रणाली विकसित की गई थी। ए. थलियाना के प्रोटोप्लास्ट का उपयोग करके पौधों में प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रियाओं का अध्ययन किया जा सकता है। इस प्रकार अंतःक्रियाओं का उनके मूल संदर्भ में अध्ययन किया जा सकता है। इस प्रणाली में जीएएल4 एडी और बीडी शक्तिशाली 35S प्रमोटर के नियंत्रण में हैं। परस्पर क्रिया को जीयूएस रिपोर्टर का उपयोग करके मापा जाता है। उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग को सक्षम करने के लिए सदिश को गेटवे संगत बनाया गया था।

प्रणाली को प्रोटोप्लास्ट टू हाइब्रिड (पी2एच) प्रणाली के रूप में जाना जाता है।[32]

एप्लीसिया कैलिफ़ोर्निका

कैलिफोर्निया समुद्री खरगोश न्यूरोबायोलॉजी में मॉडल जीव है जो दूसरों के बीच दीर्घकालिक स्मृति के आणविक तंत्र का अध्ययन करता है। न्यूरोलॉजी में महत्वपूर्ण परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए, अधिक देशी वातावरण में ए कैलिफ़ोर्निका न्यूरॉन्स में दो-संकर प्रणाली विकसित की गई है। इस प्रणाली में जीएएल4 एडी और बीडी का उपयोग किया जाता है.[33][34]

ग्रेव एमबीएक्स वन

पालतू रेशम कीट, बॉम्बेक्स मोरी (बीएमएन4 कोशिकाओं) के लार्वा या कैटरपिलर से रेशमकीट सेल लाइन में कीट दो-हाइब्रिड (आई2एच) प्रणाली विकसित की गई थी। यह प्रणाली जीएएल4 बीडी और माउस एनएफ-κB P65 के सक्रियण डोमेन का उपयोग करती है। दोनों ओपीआईई2 प्रमोटर के नियंत्रण में हैं।[35]

अनुप्रयोग

परस्पर क्रिया के लिए महत्वपूर्ण दृश्यों का निर्धारण

उपयोग किए गए प्लास्मिड में संबंधित डीएनए बेस-जोड़े को परिवर्तित कर विशिष्ट अमीनो एसिड को परिवर्तित कर, परस्पर क्रिया को बनाए रखने में उन अमीनो एसिड अवशेषों के महत्व को निर्धारित किया जा सकता है।[1]

डीएनए-बाइंडिंग प्रोटीन का चयन करने के लिए बैक्टीरियल सेल-आधारित विधि का उपयोग करने के बाद, इन डोमेन की विशिष्टता की जांच करना आवश्यक है। क्योंकि एक सीमा होती है कि बैक्टीरियल सेल जीनोम अन्य डोमेन के लिए आत्मीयता के साथ सिंक अनुक्रम (या वास्तव में, डीएनए के लिए सामान्य संबंध) के रूप में कार्य कर सकता है।[2]

दवा और जहर की खोज

प्रोटीन-प्रोटीन सिग्नलिंग परस्पर क्रिया उनकी विशिष्टता और व्यापकता के कारण उपयुक्त चिकित्सीय लक्ष्य बनाते हैं। यादृच्छिक दवा खोज दृष्टिकोण यौगिक बैंकों का उपयोग करता है। जिसमें यादृच्छिक रासायनिक संरचनाएं सम्मिलित होती हैं, और इन संरचनाओं को उनके इच्छित लक्ष्य में परीक्षण करने के लिए उच्च-थ्रूपुट विधि की आवश्यकता होती है।[1][17]

जांच के लिए चुने गए सेल को विशेष रूप से उस आणविक पहलू को प्रतिबिंबित करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है। जिसे अन्वेषक अध्ययन करने का प्रयोजन रखता है और फिर नए मानव या पशु चिकित्सीय या एंटी-कीट एजेंटों की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है।[1][17]

प्रोटीन कार्य का निर्धारण

अज्ञात प्रोटीनों के अन्योन्यक्रिया भागीदारों के निर्धारण से, इन नए प्रोटीनों के संभावित कार्यों का अनुमान लगाया जा सकता है।[1] यह अज्ञात प्रोटीन के लाइब्रेरी के खिलाफ ज्ञात प्रोटीन का उपयोग करके या इसके विपरीत, अज्ञात कार्य के एकल प्रोटीन का उपयोग करके ज्ञात प्रोटीन के लाइब्रेरी से चयन करके किया जा सकता है।[1]

जिंक फिंगर प्रोटीन चयन

प्रोटीन इंजीनियरिंग के लिए जिंक फिंगर प्रोटीन (जेडएफपी) का चयन करने के लिए दो-हाइब्रिड स्क्रीनिंग विधि से अनुकूलित विधियों का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है।[2][3] जेडएफपी अपने आप में डीएनए-बाध्यकारी प्रोटीन है। जिसका उपयोग कस्टम डीएनए-बाध्यकारी डोमेन के निर्माण में किया जाता है। जो वांछित डीएनए अनुक्रम से जुड़ता है।[36] यूएएस में सम्मिलित वांछित लक्ष्य अनुक्रम के साथ चयन जीन का उपयोग करके, और जेडएफपी लाइब्रेरी का उत्पादन करने के लिए प्रासंगिक अमीनो एसिड अनुक्रमों को यादृच्छिक बनाकर, आवश्यक विशेषताओं के साथ डीएनए-जेडएफपी परस्पर क्रिया की होस्टी करने वाली कोशिकाओं का चयन किया जा सकता है। प्रत्येक जेडएफपी सामान्यतः केवल 3-4 आधार जोड़े को पहचानता है। इसलिए यूएएस के बाहर साइटों की पहचान को रोकने के लिए, यादृच्छिक जेडएफपी को 'पाड़' में इंजीनियर किया जाता है। जिसमें निरंतर अनुक्रम के दो अन्य जेडएफपी होते हैं। इस प्रकार यूएएस को अनुक्रम के अतिरिक्त निरंतर मचान के लक्ष्य अनुक्रम को सम्मिलित करने के लिए रचना किया गया है। जिसके लिए जेडएफपी चुना गया है।[2][3]

इस प्रणाली का उपयोग करके कई अन्य डीएनए-बाध्यकारी डोमेन की भी जांच की जा सकती है।[2]

शक्तियाँ

  • दो-हाइब्रिड स्क्रीन कम विधि वाली हैं | उन्हें बिना परिष्कृत उपकरणों के किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है।
  • दो-हाइब्रिड स्क्रीन परस्पर क्रिया भागीदारों की पहचान के लिए महत्वपूर्ण पहला संकेत प्रदान कर सकती हैं।
  • परख स्केलेबल है, जो कई प्रोटीनों के बीच परस्पर क्रिया के लिए स्क्रीन करना संभव बनाता है। इसके अतिरिक्त, इसे स्वचालित किया जा सकता है, और रोबोट का उपयोग करके अपेक्षाकृत कम समय में हजारों संभावित परस्पर क्रिया करने वाले प्रोटीनों के खिलाफ कई प्रोटीनों की जांच की जा सकती है। दो प्रकार की बड़ी स्क्रीन का उपयोग किया जाता है। लाइब्रेरी दृष्टिकोण और मैट्रिक्स दृष्टिकोण है।
  • यीस्ट दो-हाइब्रिड डेटा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एपी/एमएस) के बाद कोफिनिटी शुद्धिकरण के वैकल्पिक दृष्टिकोण द्वारा उत्पन्न डेटा के समान गुणवत्ता वाले हो सकते हैं।[37][9]

अशक्तियां

  • प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रिया के यीस्ट दो-हाइब्रिड स्क्रीन पर प्रयुक्त होने वाली मुख्य आलोचना गलत सकारात्मक (और गलत नकारात्मक) पहचान की उच्च संख्या की संभावना है। गलत सकारात्मक परिणामों की सटीक दर ज्ञात नहीं है। किंतु पहले के अनुमान 70% तक उच्च थे। यह भी, आंशिक रूप से, अधिकांशतः (उच्च थ्रूपुट) दो-हाइब्रिड स्क्रीनिंग का उपयोग करते समय परिणामों में पाए जाने वाले बहुत छोटे ओवरलैप की व्याख्या करता है। विशेष रूप से विभिन्न प्रायोगिक प्रणालियों का उपयोग करते समय है।[9][28]

इस उच्च त्रुटि दर का कारण स्क्रीन की विशेषताओं में निहित है:

  • कुछ परख वेरिएंट फ्यूजन प्रोटीन को ओवरएक्सप्रेस करते हैं | जो अप्राकृतिक प्रोटीन सांद्रता का कारण बन सकता है। जो अनिर्दिष्ट (गलत) सकारात्मकता का कारण बनता है।
  • हाइब्रिड प्रोटीन फ्यूजन प्रोटीन होते हैं, अर्थात्, जुड़े हुए भाग कुछ अंतःक्रियाओं को बाधित कर सकते हैं, विशेषकर यदि परीक्षण प्रोटीन के एन-टर्मिनस पर परस्पर क्रिया होती है (जहां डीएनए-बाध्यकारी या सक्रियण डोमेन सामान्यतः जुड़ा होता है)।
  • वाई2एच के लिए विशिष्ट होस्ट जीव, यीस्ट में अंतःक्रिया नहीं हो सकती है। उदाहरण के लिए, यदि यीस्ट में जीवाणु प्रोटीन का परीक्षण किया जाता है, तो इसमें उचित तह के लिए संरक्षक की कमी हो सकती है जो केवल इसके जीवाणु होस्ट में उपस्थित होता है। इसके अतिरिक्त, स्तनधारी प्रोटीन को कभी-कभी यीस्ट में सही विधि से संशोधित नहीं किया जाता है (उदाहरण के लिए, फास्फारिलीकरण की कमी), जिससे गलत परिणाम भी हो सकते हैं।
  • वाई2एच नाभिक में होता है। यदि परीक्षण प्रोटीन नाभिक में स्थानीयकृत नहीं हैं (क्योंकि उनके पास अन्य स्थानीयकरण संकेत हैं) तो दो परस्पर क्रिया करने वाले प्रोटीन गैर-अंतःक्रियात्मक पाए जा सकते हैं।
  • कुछ प्रोटीन विशेष रूप से परस्पर क्रिया कर सकते हैं | जब वे यीस्ट में सह-अभिव्यक्त होते हैं। चूंकि वास्तव में वे एक ही समय में एक ही कोशिका में उपस्थित नहीं होते हैं। वर्तमान में, अधिकतर स्थितियोंं में इस बात से इंकार नहीं किया जा सकता है कि ऐसे प्रोटीन वास्तव में कुछ कोशिकाओं में या कुछ परिस्थितियों में व्यक्त किए जाते हैं।

इनमें से प्रत्येक बिंदु अकेले गलत परिणामों को जन्म दे सकता है। सभी त्रुटि स्रोतों के संयुक्त प्रभावों के कारण दो-संकर यीस्ट की सावधानी से व्याख्या की जानी चाहिए। गलत सकारात्मक उत्पन्न करने की संभावना का कारण है कि सभी परस्पर क्रिया की उच्च आत्मविश्वास परख द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए। उदाहरण के लिए अंतर्जात प्रोटीन का सह-इम्युनोप्रेवेरेशन, जो बड़े मापदंड पर प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रिया डेटा के लिए कठिन है। वैकल्पिक रूप से, वाई2एच डेटा को कई वाई2एच वेरिएंट का उपयोग करके सत्यापित किया जा सकता है [38] या जैव सूचना विज्ञान विधि बाद का परीक्षण कि क्या परस्पर क्रिया करने वाले प्रोटीन एक ही समय में व्यक्त किए जाते हैं | कुछ सामान्य विशेषताओं को साझा करते हैं (जैसे कि जीन ऑन्कोलॉजी एनोटेशन या कुछ नेटवर्क टोपोलॉजी), अन्य प्रजातियों में समरूप परस्पर क्रिया होती है।[39]

यह भी देखें

  • फेज प्रदर्शन , प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-डीएनए परस्पर क्रिया का पता लगाने के लिए वैकल्पिक विधि है।
  • प्रोटीन सरणी, प्रोटीन-प्रोटीन परस्पर क्रिया का पता लगाने के लिए चिप-आधारित विधि है।
  • सिंथेटिक आनुवंशिक सरणी एनालिसिस, जीन परस्पर क्रिया के अध्ययन के लिए यीस्ट-आधारित विधि है।

संदर्भ

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बाहरी संबंध

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दो-हाइब्रिड स्क्रीनिंग
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